張夢麒，趙道強，柴琇瑛，顏 宏，周理強，吳德松*

（1 云南省藥物研究所 昆明 650111 2 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室 昆明 650111）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細胞綠藻，在特定條件下會積累大量的蝦青素，含量可達細胞干重的1.5%～4.0%[1]，為蝦青素的主要天然來源之一。蝦青素是一種酮式類胡蘿卜素，化學(xué)名：3，3'-二羥基-4，4'-二酮基-β，β'-胡蘿卜素[2]，具有極強的抗氧化活性，比維生素E 高約500 倍，被認為是“超級維生素E”[3]，在保健食品和動物飼料添加劑市場應(yīng)用廣闊。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天然蝦青素除具有極強的抗氧化活性外，還具有緩解視疲勞[4]、降血糖[5]、降血脂[6]、緩解體力疲勞[7]、增強免疫力[8-12]等多種活性。美藤果（Plukenetia volubilis L.）屬大戟科美藤果屬多年生木質(zhì)藤本植物，2013年1月4日我國衛(wèi)生部正式公告美藤果油被批準(zhǔn)為新資源食品。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果證實：美藤果油具有輔助改善記憶[13]、降血脂[14-16]、抗氧化[17]和增強免疫力[18-19]等功效?；鹇槿蕿樯？浦参锎舐椋–annabis sativa L.）的干燥成熟果實，衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51 號文件《衛(wèi)生部關(guān)于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》中規(guī)定，火麻仁屬于既是食品又是藥品的原料?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，火麻仁油具有治療便秘[20-21]、抗氧化[22]、降血脂[23]、改善記憶[24]和增強免疫力[25-26]等功效。

文獻調(diào)研結(jié)果提示，蝦青素、美藤果油和火麻仁油在增強免疫力功能上存在一定的交叉和互補，它們的科學(xué)組合可能具有提升原有單一成分功效的效果。蝦青素油為油狀物，較為黏稠，具有對光敏感、遇熱不穩(wěn)定、易氧化等特性，在配方中添加食用油，可對蝦青素油進行稀釋，便于生產(chǎn)，提高成品得率；還可進一步提高蝦青素在產(chǎn)品中的穩(wěn)定性，防止蝦青素在保存過程中過度氧化引發(fā)的生物活性下降。

基于上述考慮，本文以蝦青素油、美藤果油和火麻仁油為原料制備復(fù)合蝦青素，并參照《允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養(yǎng)素補充劑（2020年版）（征求意見稿）》[27]的相關(guān)要求，對其增強免疫力功能進行綜合評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試品 復(fù)合蝦青素，成人推薦每日用量為1 g/d；深紅色油狀物，主要活性成分為蝦青素油、美藤果油和火麻仁油，由云南省藥物研究所制劑研究室提供，4 ℃避光保存。

1.1.2 試驗動物 SPF 級C57BL/6J 小鼠，體重18～22 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001。實驗動物使用許可證：SYXK（滇）K2017-0004，發(fā)證單位：昆明市科技局。

1.1.3 細胞株 YAC-1 小鼠淋巴瘤細胞，購自中國科學(xué)院昆明動物研究所細胞庫。

1.1.4 主要試劑 胎牛血清 （FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)液，Gibco 公司；刀豆蛋白 （ConA）、噻唑藍（MTT），Sigma 公司；2，4-二硝基氟苯 （DNFB），東京化成工業(yè)株式會社；印度墨汁、綿羊紅細胞（SRBC）、瓊脂糖，北京索來寶科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；JJ2000 型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；DMIL-LED 型熒光倒置相差顯微鏡，萊卡公司；AC2-6S1 型二級生物安全柜、CCL-170A-8 型CO2恒溫培養(yǎng)箱，ESCO 公司；Multiskan Go 型全波長酶標(biāo)儀，Thermo 公司；GNP-9270 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶媒對照 受試樣品的溶媒為食用玉米油。

1.3.2 劑量設(shè)定 根據(jù)復(fù)合蝦青素人體推薦劑量，即成人每日推薦劑量為16.7 mg/kg（成人體重以60 kg 計算），分別以成人每日推薦用量的10倍、20 倍和30 倍作為小鼠的飼喂劑量，分別為167，334 和501 mg/kg。

蝦青素油的飼喂劑量根據(jù)復(fù)合蝦青素高劑量進行設(shè)計，設(shè)定為300 mg/kg。

1.3.3 試驗方法 參照《允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養(yǎng)素補充劑 （2020年版）（征求意見稿）》進行功能評價。其中，細胞免疫功能測定采用ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）和DNFB 誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（耳腫脹法）；體液免疫功能測定采用抗體生成細胞檢測（Jerne's 改良玻片法） 和血清溶血素測定 （血凝法）；單核巨噬細胞功能測定采用小鼠碳廓清試驗；NK 細胞活性測定采用乳酸脫氫酶（LDH）測定法。

1.3.4 動物分組、給藥和指標(biāo)測定 取SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，按體重分層，隨后隨機分為溶媒對照組、蝦青素組、復(fù)合蝦青素低、中、高劑量組，每組12 只。自分組后開始，受試組動物均以20 mL/kg 飼喂體積灌胃給予相應(yīng)樣品，溶媒對照組給予等體積玉米油，1 次/d，連續(xù)30 d。各項功能測定試驗相關(guān)指標(biāo)測定方法參照《允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養(yǎng)素補充劑 （2020年版）（征求意見稿）》進行，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.5 評價標(biāo)準(zhǔn) 在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能及NK 細胞活性4 個方面測定中，任2 個方面試驗結(jié)果為陽性，可以判定該受試樣品具有增強免疫力作用。其中細胞免疫功能測定項目中2 個試驗的結(jié)果均為陽性，判定細胞免疫功能試驗結(jié)果陽性。體液免疫功能測定項目中2 個試驗的結(jié)果均為陽性，判定體液免疫功能試驗結(jié)果陽性。單核-巨噬細胞功能測定項目中2 個試驗的結(jié)果均為陽性，判定單核-巨噬細胞功能試驗結(jié)果陽性。NK 細胞活性測定試驗的一個以上劑量結(jié)果陽性，判定NK 細胞活性結(jié)果陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

試驗結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，蝦青素油、復(fù)合蝦青素334 mg/kg 和501 mg/kg 劑量組動物脾淋巴細胞細胞增殖水平明顯升高（P<0.05 或P<0.01）；與蝦青素油組相比，復(fù)合蝦青素334 mg/kg 和501 mg/kg 劑量組動物脾淋巴細胞增殖水平明顯升高（P<0.01），結(jié)果見表1。

表1 復(fù)合蝦青素對ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（±s）Table 1 Effects of compound astaxanthin on splenic lymphocyte proliferation induced by ConA in mice （±s）

表1 復(fù)合蝦青素對ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（±s）Table 1 Effects of compound astaxanthin on splenic lymphocyte proliferation induced by ConA in mice （±s）

注：與溶媒對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與蝦青素油組相比，▲.P<0.05，▲▲.P<0.01。

組別 劑量/mg·kg-1 體質(zhì)量/g 脾淋巴細胞增殖△OD570nm給藥0 d 給藥30 d溶媒對照組-19.63±1.34 23.89±1.36 0.32±0.03蝦青素油 300 19.54±1.27 23.28±1.20 0.35±0.04*復(fù)合蝦青素 167 19.88±1.36 23.77±1.59 0.35±0.04 334 19.50±1.11 23.94±1.52 0.42±0.06**▲▲501 19.41±0.65 23.50±1.82 0.43±0.05**▲▲

2.2 對DNFB 誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型耳腫的影響

試驗結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，蝦青素油、復(fù)合蝦青素167，334，501 mg/kg 劑量組動物耳腫脹度均明顯增加（P<0.05 或P<0.01）；與蝦青素油組相比，復(fù)合蝦青素167，334 mg/kg 和501 mg/kg 劑量組動物耳腫脹度均明顯增加（P<0.05），結(jié)果見表2。

表2 復(fù)合蝦青素對DNFB 誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型耳腫的影響（±s）Table 2 Effects of compound astaxanthin on DNFB-induced delayed ear edema in mice （±s）

表2 復(fù)合蝦青素對DNFB 誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型耳腫的影響（±s）Table 2 Effects of compound astaxanthin on DNFB-induced delayed ear edema in mice （±s）

注：與溶媒對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與蝦青素油組相比，▲.P<0.05，▲▲.P<0.01。

組別 劑量/mg·kg-1 體質(zhì)量/g 耳腫脹度/mg給藥0 d 給藥30 d溶媒對照組-18.80±1.05 23.45±1.18 7.37±2.23蝦青素油 300 18.99±0.85 23.04±1.17 9.25±1.83*復(fù)合蝦青素 167 18.87±0.54 23.16±0.56 10.96±2.00**▲334 19.03±1.28 22.94±1.48 11.28±2.62**▲501 18.41±0.73 22.50±1.63 11.17±2.27**▲

2.3 對小鼠抗體生成的影響

試驗結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，蝦青素油和復(fù)合蝦青素167，334，501 mg/kg 劑量組動物溶血空斑數(shù)明顯增加（P<0.05），結(jié)果見表3。

表3 復(fù)合蝦青素對小鼠抗體生成的影響（±s）Table 3 Effects of compound astaxanthin on antibody production in mice （±s）

表3 復(fù)合蝦青素對小鼠抗體生成的影響（±s）Table 3 Effects of compound astaxanthin on antibody production in mice （±s）

注：與溶媒對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與蝦青素油組相比，▲.P<0.05，▲▲.P<0.01。

組別 劑量/mg·kg-1 體質(zhì)量/g 溶血空斑數(shù)×103/全脾細胞給藥0 d 給藥30 d溶媒對照組-20.44±0.98 25.48±1.88 170.59±48.09蝦青素油 300 20.23±1.23 25.16±1.78 233.25±80.17*復(fù)合蝦青素 167 20.59±1.54 24.35±1.54 218.33±59.12*334 20.27±1.39 25.20±1.76 230.76±65.34*501 20.68±0.96 25.07±1.99 238.57±70.41*

2.4 對小鼠血清溶血素生成的影響

試驗結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，復(fù)合蝦青素167 mg/kg 和334 mg/kg 劑量組動物血清抗體水平明顯增加（P<0.01），復(fù)合蝦青素501 mg/kg 劑量組動物血清抗體水平明顯增加（P<0.01），結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合蝦青素對小鼠血清溶血素生成的影響（±s）Table 4 Effects of compound astaxanthin on serum hemolysin production in mice （±s）

表4 復(fù)合蝦青素對小鼠血清溶血素生成的影響（±s）Table 4 Effects of compound astaxanthin on serum hemolysin production in mice （±s）

注：與溶媒對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與蝦青素油組相比，▲.P<0.05，▲▲.P<0.01。

組別 劑量/mg·kg-1 體質(zhì)量/g 抗體水平給藥0 d 給藥30 d溶媒對照組-19.23±2.38 24.12±2.36 36.58±9.10蝦青素油 300 19.16±2.01 24.48±1.60 53.75±14.27**復(fù)合蝦青素 167 19.30±1.11 23.99±1.40 64.58±9.86**▲334 19.22±1.22 24.11±1.97 71.33±13.26**▲▲501 18.97±0.98 24.30±1.25 67.17±7.69**▲▲

2.5 對小鼠碳粒廓清能力的影響

試驗結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，蝦青素油和復(fù)合蝦青素各劑量組動物吞噬指數(shù)α 均無明顯變化（P>0.05），結(jié)果見表5。

表5 復(fù)合蝦青素對小鼠碳粒廓清的影響（±s）Table 5 Effects of compound astaxanthin on carbon clearance in mice （±s）

表5 復(fù)合蝦青素對小鼠碳粒廓清的影響（±s）Table 5 Effects of compound astaxanthin on carbon clearance in mice （±s）

注：與溶媒對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與蝦青素油組相比，▲.P<0.05，▲▲.P<0.01。

?

2.6 對NK 細胞活性的影響

試驗結(jié)果顯示，與溶媒對照組相比，蝦青素油和復(fù)合蝦青素各劑量組動物L(fēng)DH 活力均無明顯變化（P>0.05），結(jié)果見表6。

表6 復(fù)合蝦青素對小鼠NK 細胞活性的影響（±s）Table 6 Effect of compound astaxanthin on the activity of mouse NK cells （±s）

表6 復(fù)合蝦青素對小鼠NK 細胞活性的影響（±s）Table 6 Effect of compound astaxanthin on the activity of mouse NK cells （±s）

注：與溶媒對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與蝦青素油組相比，▲.P<0.05，▲▲.P<0.01。

組別 劑量/mg·kg-1 體質(zhì)量/g LDH 活力/U·L-1給藥0 d 給藥30 d溶媒對照組-20.01±1.05 23.49±1.38 287.73±38.20蝦青素油 300 20.11±1.15 24.33±2.01 280.35±42.14復(fù)合蝦青素 167 20.20±1.22 24.06±1.52 270.02±38.06 334 20.30±1.19 23.84±2.10 287.38±33.73 501 20.16±1.23 23.83±1.95 273.46±44.96

3 討論

免疫是人體的一種正常的生理功能，機體依靠這種功能識別和清除進入人體的抗原物質(zhì)（如病原微生物、寄生蟲等） 或人體自身所產(chǎn)生的衰老、損傷、死亡和突變細胞等，以維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保持機體的健康。當(dāng)人體免疫功能減退時，機體的識別和監(jiān)視能力下降，導(dǎo)致機體無法及時、有效地清除有害因素，從而誘導(dǎo)疾病的發(fā)生。近年來，由于環(huán)境污染加劇、生活節(jié)奏的加快和不健康的生活方式等因素的影響，處于亞健康狀態(tài)的人群范圍逐漸擴大，機體免疫功能低下的人群有逐年增加的趨勢，其年齡范圍也逐漸從中老年人向年輕人擴散。人體免疫功能低下最直接的表現(xiàn)就是對疾病的抵抗力下降，導(dǎo)致部分疾病反復(fù)發(fā)作。由于免疫功能低下者經(jīng)常患病，加重了機體的消耗，所以免疫功能低下者一般還有體質(zhì)虛弱、精神萎靡、疲乏無力、食欲降低、睡眠障礙等表現(xiàn)，嚴(yán)重影響人們的生活和工作。因此，開發(fā)一款具有維持人體正常免疫功能的保健食品具有較好的現(xiàn)實意義和社會價值。

通過前期文獻調(diào)研，本文在蝦青素油的基礎(chǔ)上添加了美藤果油和火麻仁油，制備成復(fù)合蝦青素，并對其增強免疫力功能進行了綜合評價，也與單獨使用蝦青素油的功效進行了對比。研究結(jié)果顯示：蝦青素油和復(fù)合蝦青素均可明顯提升小鼠脾淋巴細胞增殖水平、顯著提升小鼠遲發(fā)性耳腫脹度，細胞免疫功能測定結(jié)果陽性，且復(fù)方蝦青素的活性優(yōu)于蝦青素油單用。同時，蝦青素油和復(fù)合蝦青素均可明顯提升小鼠抗體生成水平，體液免疫功能測定結(jié)果陽性，且復(fù)方蝦青素的活性優(yōu)于蝦青素油單用。然而，在單核巨噬細胞吞噬能力和NK 細胞活性方面，蝦青素油和復(fù)合蝦青素均未表現(xiàn)出明顯的活性，未達到前期配伍設(shè)計的預(yù)期。后續(xù)還需要對配方進行調(diào)整，以獲得更高的活性。

綜上所述，參照《增強免疫力功能評價方法（征求意見稿）》的評價標(biāo)準(zhǔn)，可判定蝦青素油和復(fù)合蝦青素均具有增強免疫力的功能，其中復(fù)合蝦青素的活性優(yōu)于蝦青素油單用，具備進一步深入開發(fā)的價值。