唐婉，王小樂，袁小庚，韓雪瑩，張暋

（鄭州金域臨床檢驗中心有限公司，河南 鄭州 450016）

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）是一組起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，特征表現(xiàn)為一系或多系成熟髓系細(xì)胞過度增殖，常伴有肝、脾腫大和出血傾向、血栓形成及髓外造血［1］。根據(jù)2016年第4版WHO造血與淋巴系統(tǒng)腫瘤分類目錄，經(jīng)典的MPN包括費(fèi)城染色體（philadelphia chromosome，Ph）陰性的真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）、原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）和BCR－ABL融合陽性的慢性髓細(xì)胞性白血?。╟hronic myelogenous leukaemia，CML）［2］；臨床診斷分型除血常規(guī)檢驗外，還依賴細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)，即MICM診斷體系。骨髓活檢和骨髓涂片用于辨別骨髓細(xì)胞形態(tài)和病理特征，流式細(xì)胞術(shù)用于辨識骨髓血細(xì)胞免疫表型，而染色體核型分析和驅(qū)動基因突變檢測則有助于疾病分型及預(yù)測預(yù)后［3］。

本研究整理回顧所收集的經(jīng)典型MPN確診病例的基本信息和各項檢查結(jié)果，按疾病亞型分組，分析MICM框架下多種檢測方法聯(lián)合應(yīng)用在MPN診斷、分型、預(yù)后中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 資料收集2019年1月至2021年5月河南省轄各市縣（包括17個地級市和1個省直轄縣級市）醫(yī)療機(jī)構(gòu)送檢鄭州金域臨床檢驗中心有限公司的已確診或疑診為MPN的病例，結(jié)合臨床信息及在本公司實驗室獲得的骨髓病理及分子檢測結(jié)果，排除診斷為其他或疾病未明的，最終篩選出1 182例可確診為MPN的病例，患者年齡1～89歲，中位年齡63歲，其中男560例，女622例。

1.2 方法實驗室檢測方案依據(jù)MICM診斷體系，結(jié)合骨髓形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等多技術(shù)平臺檢測優(yōu)勢，為MPN的診斷分型提供客觀依據(jù)。

1.2.1 骨髓活檢和骨髓涂片法 采用骨髓活檢和骨髓涂片法辨別骨髓細(xì)胞形態(tài)和病理特征。骨髓活檢組織標(biāo)本經(jīng)預(yù)處理后包埋并制成切片，采用蘇木精－伊紅染色法和網(wǎng)狀纖維染色法進(jìn)行常規(guī)染色，光鏡下觀察并描述鏡下所見；骨髓涂片標(biāo)本進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色，低倍鏡下觀察200個有核細(xì)胞，對所觀察的細(xì)胞進(jìn)行分類并計數(shù)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 采用流式細(xì)胞術(shù)識別骨髓血細(xì)胞免疫表型，檢測抗體包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD33、CD34、CD36、CD45、CD56、CD7、CD64、CD117、CD71、CD41、HLA－DR、IgG1、Kappa、Lambda、CD38、CD138等，取EDTA抗凝骨髓100μL分別加入相應(yīng)的抗體組合試管中，充分混勻、孵育、裂解紅細(xì)胞、洗滌及固定，在FC500－MXP流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測并分析。

1.2.3 核型分析 采用G顯帶法核型分析觀察染色體異常，應(yīng)用短期培養(yǎng)法培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，制成染色體分析標(biāo)本并應(yīng)用G顯帶技術(shù)顯帶，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN，2009）》進(jìn)行核型描述。

1.2.4 基因突變檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、毛細(xì)管電泳、下一代測序（next generation sequencing，NGS）等檢測基因突變。采用Qiagen 51106 QIAamp DNA Blood Mini Kit和52304 QIAamp RNA Blood Mini kit試劑盒分別提取骨髓樣本中DNA和RNA。

1.2.4.1 實時熒光定量PCR 應(yīng)用ABI 7500實時熒光PCR儀定量分析JAK2 V617F突變及BCR－ABL融合基因。JAK2定量分析采用Qiagen 673613 JAK2 RGQ PCR Kit試劑盒分別對V617F突變型和野生型DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測，通過計算V617F突變型所占百分比，判斷患者JAK2基因V617F突變狀態(tài)。

BCR－ABL融合基因定性檢測需從骨髓或外周血樣本中提取RNA，使用上海源奇白血病相關(guān)融合基因突變檢測試劑盒進(jìn)行檢測，以ABL基因為內(nèi)參對照，報告BCR－ABL融合基因與內(nèi)參ABL基因的拷貝數(shù)比值，并以百分?jǐn)?shù)的形式表示。檢測范圍覆蓋p190、p210、p230融合型。

1.2.4.2 毛細(xì)管電泳 采用毛細(xì)管電泳片段分析法檢測CALR基因9號外顯子的插入／缺失突變，下機(jī)數(shù)據(jù)使用GENEMAPPER V5.0分析；Sanger測序法檢測MPL基因W515位點及JAK2基因12、13號外顯子突變，應(yīng)用Sequencher軟件分析測序峰圖，依據(jù)人類基因組變異協(xié)會（Human Genome Variation Society，HGVS）規(guī)則命名變異，毛細(xì)管電泳和Sanger測序所用基因分析儀型號為ABI 3500xL Dx。

1.2.4.3 NGS 定制探針靶向捕獲MPN相關(guān)基因（ABL1、ASXL1、ATG2B、BLM、CALR、CBL、CDKN2A、CSF3R、DNMT3A、EGLN1、EZH2、IDH1、IDH2、JAK2、KRAS、MPL、MYC、NRAS、PDGFRA、PDGFRB、RUNX1、SETBP1、SF3B1、SH2B3、SRSF2、TET2、TP53、U2AF1）外顯子區(qū)域，KAPA 試劑構(gòu)建文庫，應(yīng)用illumina Novaseq儀器上機(jī)測序，可檢測的突變類型有點突變、小片段插入／缺失、剪切子變異等，測序深度可達(dá)1 000X以上。

2 結(jié)果

2.1 河南地區(qū)經(jīng)典MPN患者群體特征在1 182例確診為MPN的病例中，患者年齡范圍為1～89歲，其中男560例（47.3%）、女622例（52.7%）；經(jīng)綜合分析臨床信息和實驗室檢查結(jié)果，共有1 134例（95.9%）確診為經(jīng)典型MPN，性別和年齡段分布見表1。

數(shù)據(jù)顯示，總體上50～79歲的患者人數(shù)最多，占比76.5%。按亞型分類，分別有28.2%、43.2%、16.2%和12.3%的病例確診為PV、ET、PMF和CML。從年齡分布來看，PV和PMF的發(fā)病年齡均不早于30歲，ET可在10歲以后發(fā)病，而CML發(fā)病年齡可提早至1～10歲。統(tǒng)計分析各亞型患者性別比例，PV和PMF組男、女患者占比相當(dāng)；ET和CML中男、女患者占比均不同，ET組男、女比例約為2∶3，而CML組為3∶2。對比疾病最高發(fā)年齡段發(fā)現(xiàn)PV和PMF男、女均為60～69歲；而ET和CML有所不同，ET女性患者為70～79歲，較男性患者晚，CML男性患者為50～59歲，較女性患者早。

在確診為PV的病例中，臨床多描述有紅細(xì)胞增多、全血細(xì)胞增多、三系升高等血象，個別有白細(xì)胞增高，其中7例確診為隱匿性PV，1例伴有腦梗死，1例有慢性乙肝病史。ET患者最顯著的特征有血小板、白細(xì)胞升高，個別病例有頭痛、脾大、消化道出血；1例有腦梗死和高血壓，1例伴有冠心病，2例伴有貧血。PMF患者特征多為白細(xì)胞升高、全血細(xì)胞減少以及骨髓纖維化，部分患者臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、脾大或貧血；CML血象多數(shù)表現(xiàn)為白細(xì)胞顯著升高，5例有血小板升高表現(xiàn)，81例診斷為慢性期，1例診斷為急性期。其余48例MPN因現(xiàn)有臨床證據(jù)不足或檢測結(jié)果不全無法分型，未進(jìn)行群體特征分析。

2.2 實驗室檢查結(jié)果統(tǒng)計

2.2.1 骨髓活檢及骨髓涂片檢測結(jié)果 本研究中，PV、ET、PMF和CML組分別有293例（91.6%）、477例（97.4%）、172例（93.5%）、116例（82.9%）的患者接受了骨髓活檢檢查；分別有218例（68.1%）、264例（53.9%）、94例（51.1%）、76例（54.3%）的患者選擇了骨髓涂片檢查。經(jīng)典MPN 4種亞型中，骨髓活檢檢出率均高于骨髓涂片。見表2。此外，骨髓活檢結(jié)果提示了7例隱匿性PV。在PMF中提示了疾病分級，診斷44例為纖維化前期、10例MF－1級、29例MF－2級和25例MF－3級；在CML中，81例依據(jù)活檢結(jié)果診斷為慢性期。

表2 PV、ET、PMF、CML骨髓活檢和骨髓涂片檢出率（%）

2.2.2 常見驅(qū)動基因突變檢測結(jié)果 經(jīng)典型MPN常見的驅(qū)動突變?yōu)镴AK2基因V617F、JAK2基因外顯子12／13、CALR基因外顯子9的缺失／插入突變、MPL基因W515位點突變以及BCR－ABL基因融合。在Ph陰性的MPN中檢出率最高的為V617F突變，在PV中可達(dá)90%以上，在ET和PMF中的檢出率約為70%。JAK2外顯子12／13突變罕見，在PV中檢出率最高，但不及3%。CALR缺失／插入突變僅在ET和PMF中檢出且檢出率相近，主要為缺失52堿基的L367fs*46突變，插入5堿基的K385fs*4突變次之，其他突變類型少見。MPL基因W515同樣僅在ET和PMF中檢出，檢出率均小于5%，氨基酸改變形式以W515L居多，其次為W515K／A／R。CML中僅檢出BCR－ABL基因融合，檢出率為100%。見表3。

表3 常見驅(qū)動基因突變位點檢出率比較［n（%）］

PV、ET和PMF組中分別有284、449和167例檢測了上述4種驅(qū)動突變，大部分Ph陰性MPN病例僅檢測到1種驅(qū)動突變，即“單陽型”；少部分病例未檢測到上述任一變異，簡稱為“三陰性”Ph陰性MPN；有極少數(shù)病例檢測到2種驅(qū)動突變，即“雙陽型”。PV組中，有1例JAK2基因V617與12號外顯子共突變；ET組中，有10例JAK2基因V617與CALR基因共突變，1例JAK2基因V617與MPL基因W515共突變，PMF組中發(fā)現(xiàn)2例JAK2基因V617與MPL基因W515突變雙陽性。較PV和PMF組，ET單陽型的比例略低，而三陰型和雙陽型比例略高。見表4。

表4 Ph陰性MPN驅(qū)動突變類型頻率比較（%）

2.2.3 核型分析結(jié)果 經(jīng)典型MPN的核型異常均以結(jié)構(gòu)異常為主，主要有缺失、插入、重復(fù)、倒位等。4種亞型相比，CML異常核型檢出率最高，結(jié)構(gòu)異常檢出率超過95%，所有結(jié)構(gòu)異常的病例均檢測到t（9；22）（q34；q11.2），其中2例伴有數(shù)目異常。PV中檢測到＋9、－12、－22等數(shù)目異常，ET和PMF中以＋8最常見。見表5。

表5 核型異常檢出率比較［n（%）］

2.3 MPN相關(guān)基因突變統(tǒng)計在PV、ET、PMF和CML中分別有32例、38例、21例和13例MPN相關(guān)基因檢測NGS套餐檢測結(jié)果，分別占各組全部確診患者的10.0%、7.8%、11.4%和9.3%。

在PV組中，32例均檢測到JAK2 V617F突變，其中20例單有V617突變（占比62.5%），4例伴有ASXL1基因突變，6例伴有TET2基因突變，2例伴有ATG2B基因突變，分別各有1例伴有DNMT3A、BLM和IDH2基因突變。在ET組中，22例檢測到JAK2 V617F突變，其中10例單有V617突變，伴有TET2和DNMT3A基因突變的各有3例，另外3例分別伴有BLM、CBL、SF3B1和SRSF2基因突變；7例CALR突變，4例伴有DNMT3A、TET2、SH2B3基因突變中的1種或2種；1例MPL基因突變，其中1例伴有DNMT3A和TET2突變。與PV相比，ET組基因突變譜較復(fù)雜，2～3基因共突變的有18例，占比約50%。在PMF組中，有16例檢測到JAK2 V617F突變，除3例外，其余還伴有其他基因突變，其中9例伴ASXL1基因突變，其他伴隨出現(xiàn)的突變基因有IDH1（2例）、ATG2B（1例）、SF3B1（2例）、KRAS（1例）、DNMT3A（1例）、CSF3R（1例）；有4例檢測到CALR突變，其中3例伴TET2，1例伴DNMT3A；1例單獨檢測到MPL突變。共有17例有2種及以上基因突變，其中JAK2伴ASXL1突變最多。在CML組中，僅有5例檢測結(jié)果為陽性，分別為2例ASXL1、1例CBL、1例MYC和1例STAG2單獨突變，基因突變譜較為單一。

3 討論

本研究所收集的1 182例河南地區(qū)經(jīng)典型MPN病例覆蓋地區(qū)廣，入組人群年齡范圍較大，具有一定的代表意義。在臨床信息和檢測結(jié)果充分的基礎(chǔ)上95%以上的病例得以確診分型。按照疾病亞型、性別和年齡分組統(tǒng)計有益于辨識不同亞型患者的特征，從而為疾病的預(yù)防和診療提供參考。河南地區(qū)經(jīng)典型MPN高發(fā)年齡為50～79歲，按照發(fā)病率高低排序依次為ET、PV、PMF、CML。PV和PMF男女患者比例相當(dāng)，ET女性患者較多，CML可累及嬰幼兒。目前尚未發(fā)現(xiàn)河南或國內(nèi)其他地區(qū)大規(guī)模MPN群體特征統(tǒng)計數(shù)據(jù)的其他報道，無法進(jìn)行比較，本研究所涉及的病例數(shù)及時間范圍畢竟有限，僅供參考。

本研究表明，詳細(xì)的臨床信息和全面的實驗室檢查結(jié)果對于MPN的診斷分型必不可少。血常規(guī)等檢查結(jié)果作為臨床信息通常由送檢的醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供，流式細(xì)胞術(shù)檢測快速，可用于分析骨髓血細(xì)胞免疫表型，分析原始細(xì)胞占比，是輔助診斷重要的技術(shù)之一。骨髓活檢和骨髓涂片是診斷血液病最常用的細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測手段，對疾病的診斷、分型和分期具有重要的參考價值。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，接受骨髓活檢檢查的患者人數(shù)占比較骨髓涂片高30% ～40%，骨髓活檢在4種疾病亞型的檢出率普遍在80%以上，PMF中最高，可達(dá)到92%，而骨髓涂片僅能提示10%的PMF。同樣地，PV組骨髓活檢的檢出率高于骨髓涂片。此外，骨髓活檢還有助于CML分期。由此可見，在經(jīng)典型MPN中骨髓活檢更具診斷價值。但仍然建議在條件許可的情況下兩者兼用，避免漏診其他髓系疾?。?－7］。

隨著實驗室和臨床研究的進(jìn)展，越來越多的MPN相關(guān)基因及其診斷預(yù)后意義被列入國內(nèi)外指南和共識。本研究中入組病例MPN驅(qū)動基因的檢測率達(dá)90%以上，JAK2 V617F和BCR－ABL融合基因最高，二者變異檢出率也最高，CML中染色體核型異常檢出率達(dá)95%，與BCR－ABL融合基因檢出率基本一致，兩者結(jié)合可作為CML主要診斷依據(jù)。JAK2 V617因在PV、ET和PMF中均有檢出不能作為分型的依據(jù)；但根據(jù)目前的研究結(jié)果，攜帶CALR和MPL基因突變的MPN基本可排除PV［8］。Sanger測序及NGS結(jié)果均顯示JAK2 12、13外顯子突變檢出率最低，針對經(jīng)濟(jì)狀況稍差的患者，可在其他診斷證據(jù)不足時再考慮檢測。CALR和MPL基因突變有助于確診MPN，但在鑒別診斷ET和PMF時需結(jié)合其他檢查結(jié)果，如骨髓活檢。約90%以上的MPN僅攜帶1種驅(qū)動基因突變，與PV和PMF相比，ET驅(qū)動基因單陽頻率略低，而三陰性和驅(qū)動突變雙陽性的頻率略高，結(jié)合NGS檢測結(jié)果分析，ET的基因突變譜可能最為復(fù)雜，PMF次之。本次研究未在PV中發(fā)現(xiàn)JAK2與CALR或MPL共突變的情況，NGS結(jié)果也顯示JAK2突變占主導(dǎo)地位，是基因突變譜較為“單純”的亞型。CML組NGS結(jié)果多為陰性，而其驅(qū)動突變的高檢出率證實其突變譜較為單一，但此次入組病例較少，還需更多數(shù)據(jù)加以證實。有文獻(xiàn)報道了JAK2、CALR、MPL單驅(qū)動基因突變及三陰型在PV、ET和PMF中的檢出率［9］，本次研究結(jié)果與之對比，基本符合。

據(jù)統(tǒng)計，絕大多數(shù)疑診為MPN的患者優(yōu)先選擇了快速的驅(qū)動突變檢測小套餐，僅有約10%的患者選擇了NGS檢測的MPN相關(guān)基因套餐。但最新的NCCN指南提示，除經(jīng)典的驅(qū)動基因外，某些基因突變對預(yù)后有重要影響，如在PMF中，CALR突變而ASXL1未突變的類型預(yù)后最好（平均生存期10.4 a），反之最差（平均生存期2.3 a），兩者同時突變或不突變的預(yù)后中等（平均生存期5.8 a）。本研究中有42.9%的PMF患者為ASXL1＋／CALR－型，提示預(yù)后較差。在PV中，ASXL1、IDH1／2、RUNX1、SRSF2、SF3B1也是預(yù)后預(yù)測的重要因子。本次研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A和TET2突變頻率也較高，在PV、ET及PMF中都有檢出，有文獻(xiàn)報道TET2、DNMT3A為DNA甲基化調(diào)節(jié)因子，可能先于JAK2 V617突變，在推動疾病進(jìn)展中起作用［10］。臨床應(yīng)推薦已初步確診分型的患者進(jìn)一步接受NGS檢測以明確預(yù)后和后續(xù)監(jiān)測。

各種檢測技術(shù)各有優(yōu)劣，相輔相成。qPCR、毛細(xì)管電泳等技術(shù)檢測速度快，但檢測的基因突變位點有限，通量不高，Sanger測序較NGS快速，但僅能檢測已知突變，靈敏度低，突變頻率低于10%時極大概率漏檢，不適用于療效監(jiān)測。有研究報道，應(yīng)用全外顯子二代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了三陰性MPN患者存在非典型驅(qū)動突變和非驅(qū)動基因突變，有助于解釋其發(fā)病機(jī)制［11］。此外，在臨床實踐中NGS對于殘留病灶或疾病進(jìn)展的監(jiān)測以及靶向治療效果預(yù)測方面具有積極作用，可使患者收益［12］。針對經(jīng)濟(jì)條件較好的患者，應(yīng)推廣NGS檢測，有助于發(fā)現(xiàn)更多與疾病相關(guān)的基因突變信息，從而不斷完善疾病數(shù)據(jù)庫，促進(jìn)靶向藥物的開發(fā)及更多的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。綜上，全面的實驗室檢查對疾病的確診、分型及預(yù)后具有重要的意義，臨床需要結(jié)合疾病的特征及技術(shù)的優(yōu)劣勢選擇合適的檢查項目，以期快速精準(zhǔn)地獲得診療依據(jù)。

本研究基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)對河南地區(qū)MPN患者的群體特征及實驗室檢查結(jié)果做了一個回顧性統(tǒng)計分析，以期為臨床診療提供一些參考，但礙于臨床信息有限，結(jié)論存在一定局限性，需更多數(shù)據(jù)加以佐證。