李瑞，張文藝，應(yīng)彥祺，魯笑欽

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014）

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)達國家最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢。盡管子宮內(nèi)膜癌患者總生存率相對較高，并且約50%的高?；颊卟粫?fù)發(fā)，但是仍有10%～15%的低?；颊邥?fù)發(fā)［1］。腫瘤的病理分型、分級、患者的臨床因素都會影響到疾病預(yù)后。即使是同一組織類型，也會存在不同的疾病預(yù)后。隨著精準醫(yī)學(xué)推進，研究者們越發(fā)關(guān)注子宮內(nèi)膜癌在分子層面的改變。2013年基于美國癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)，子宮內(nèi)膜癌分為POLE突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、低拷貝型、高拷貝型［2］?，F(xiàn)今基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)將子宮內(nèi)膜癌分類為POLE突變型、錯配修復(fù)缺陷型、非特異型、p53突變型［3］。研究者們越來越關(guān)注子宮內(nèi)膜癌分子層面的差異，旨在進一步對癌癥進行分類，為患者帶來更為精準且個體化的治療方案。

基因組不穩(wěn)定性（genomic instability，GI）是癌癥進化的基礎(chǔ)，與耐藥性和預(yù)后不良有關(guān)［4］。染色體不穩(wěn)定可導(dǎo)致細胞的基因組改變，從而無限制地促進細胞增殖［5］。DNA錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因在維持基因組穩(wěn)定方面起著重要作用。MMR基因突變破壞了其錯配修復(fù)功能，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并導(dǎo)致以林奇綜合征為代表的基因突變攜帶者患癌癥的風(fēng)險增加［6］。林奇綜合征與子宮內(nèi)膜癌的遺傳易感性相關(guān)，因為由于DNA錯配修復(fù)基因突變導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)表達差異，影響基因組的穩(wěn)定性［7］。

減數(shù)分裂結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶1（essential meiotic structure－specific endonuclease 1，EME1）基因?qū)τ诰S持基因組穩(wěn)定性起到重要作用，EME1缺失可導(dǎo)致DNA損傷后姐妹染色單體的交換增加［4］。有研究發(fā)現(xiàn)對于EME1缺失的胚胎干細胞其姐妹染色單體交換是野生型胚胎干細胞的2倍，EME1在胃癌中高表達，其表達水平與胃癌的分化水平和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，敲降EME1表達顯著抑制胃癌的增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞凋亡和細胞周期阻滯［8］。在乳腺癌中，EME1高表達與患者不良預(yù)后相關(guān)［9］。但是EME1目前與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系尚不明確。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)分析EME1在子宮內(nèi)膜癌中的表達、與患者預(yù)后的關(guān)系及潛在作用機制，擬為深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 EME1在子宮內(nèi)膜癌中的表達及預(yù)后分析使用在線工具UALCAN（http：／／ualcan.path.uab.edu／index.html）分析EME1 mRNA表達水平，該網(wǎng)站收錄了子宮內(nèi)膜癌樣本546例，正常子宮內(nèi)膜樣本35例。使用Kaplan Meier plotter數(shù)據(jù)庫（http：／／kmplot.com／analysis／）對EME1進行生存分析，該網(wǎng)站收錄子宮內(nèi)膜癌樣本543例，依據(jù)EME1 mRNA表達水平中位值進行分組，分為高表達組和低表達組，進行總生存率（overall survival，OS）及無復(fù)發(fā)生存率（relapse－free survival，RFS）分析。

1.2 EME1相關(guān)基因使用在線工具STRING（https：／／cn.string－db.org／）進行蛋白質(zhì)互作（proteinprotein interaction，PPI）分析，尋找與EME1蛋白緊密關(guān)聯(lián)的基因，設(shè)置物種為智人，選擇最高關(guān)聯(lián)度0.900，選取與EME1關(guān)系最為密切的前10位基因。

1.3 EME1及相關(guān)基因的富集分析使用DAVID網(wǎng)站（https：／／david.ncifcrf.gov／）對EME1及10位相關(guān)基因進行富集分析，探索EME1及其相關(guān)基因的生物學(xué)功能。選取包含EME1的富集結(jié)果，當P＜0.05且FDR＜0.05被認為是顯著富集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 EME1的甲基化水平及拷貝數(shù)使用在線工具UALCAN（http：／／ualcan.path.uab.edu／index.html）分析EME1基因啟動子甲基化水平。使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫（https：／／www.cbioportal.org／）對EME1基因進行拷貝數(shù)變異分析。

1.5 EME1潛在轉(zhuǎn)錄因子使用hTFtarget在線工具（http：／／bioinfo.life.hust.edu.cn／hTFtarget／＃！／）預(yù) 測基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點，組織限定為子宮內(nèi)膜。使用在線工具UALCAN分析轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，使用Kaplan Meier plotter數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)錄因子進行生存分析，使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫（https：／／www.cbioportal.org／）對EME1與潛在轉(zhuǎn)錄因子進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 EME1在子宮內(nèi)膜癌中高表達且不利預(yù)后通過在線工具UALCAN分析EMEI在子宮內(nèi)膜癌中的表達，結(jié)果表明相較于正常子宮內(nèi)膜組織，EME1在子宮內(nèi)膜癌中高表達（P＜0.001）（圖1A）。臨床病理分析發(fā)現(xiàn)，EME1的表達與腫瘤分期無關(guān)（圖1B），與腫瘤病理分型有關(guān)（圖1C）。EME1在漿液性癌（P＜0.001）及混合型癌（P＝0.044）中的表達水平高于子宮內(nèi)膜樣癌。通過Kaplan－Meier plotter數(shù)據(jù)庫繪制EME1生存曲線，發(fā)現(xiàn)EME1與子宮內(nèi)膜癌患者總生存率（圖2A）及無復(fù)發(fā)生存率（圖2B）相關(guān)，可作為潛在的不良預(yù)后因子。EME1表達水平越低，患者總生存率（P＝0.001）及無復(fù)發(fā)生存率（P＝0.018）越高。

圖1 EME1在子宮內(nèi)膜癌中的表達情況

圖2 EME1與子宮內(nèi)膜癌患者生存率關(guān)系

2.2 EME1及其相關(guān)基因EME1基因可以翻譯成蛋白質(zhì)行使生物學(xué)功能。因此，通過STRING數(shù)據(jù)庫對EME1進行蛋白質(zhì)互作分析查找最密切相關(guān)的前10位蛋白，其基因名分別為BRCA1、TOP3A、RAD51、SLX4、ERCC4、MUS81、EXO1、RMI1、RMI2、BLM（圖3）。對EME1及10位相關(guān)基因共同進行GO富集分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因集中在“核質(zhì)”“霍利迪連接體解離酶復(fù)合物”等細胞組分，涉及“DNA結(jié)合”“脫氧核糖核酸內(nèi)切酶”等分子功能，“DNA修飾”“鏈間交聯(lián)損傷修復(fù)”等生物過程，“范可尼貧血途徑”“同源重組”等信號通路（表1）。

表1 EME1的GO和KEGG富集分析

圖3 EME1密切相關(guān)的10個蛋白

2.3 EME1機制探索為了進一步探索子宮內(nèi)膜癌中EME1高表達的潛在機制，使用UALCAN數(shù)據(jù)庫對EME1基因啟動子甲基化分析，發(fā)現(xiàn)正常子宮內(nèi)膜與子宮內(nèi)膜癌的甲基化水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.160）（圖4A）。但是通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌患者中，當EME1基因拷貝數(shù)值越大，EME1 mRNA表達量越高（r＝0.260，P＜0.001）（圖4B）。

圖4 EME1基因表達狀態(tài)

使用hTFtarget預(yù)測EME1潛在轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)目標轉(zhuǎn)錄因子ESR1。ESR1蛋白與EME1 DNA序列存在潛在結(jié)合位點，該位點位于17號染色體，范圍50 372 893～50 373 256，峰位于啟動子區(qū)域，峰富集分數(shù)為17.4，距離EME1轉(zhuǎn)錄起始位點上游327堿基對（圖5）。通過UALCAN表達分析發(fā)現(xiàn)，ESR1在子宮內(nèi)膜癌中低表達（P＜0.001）（圖6A）。對ESR1進行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，ESR1高表達與子宮內(nèi)膜癌患者總生存率高相關(guān)（P＜0.001）（圖6B），與無復(fù)發(fā)生存率高相關(guān)（P＝0.031）（圖6C）。使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫對EME1與ESR1進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ESR1 mRNA與EME1 mRNA二者在子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)負相關(guān)（r＝－0.280，P＜0.001）（圖6D）。

圖5 EME1潛在轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

圖6 ESR1 mRNA表達水平、對生存率的影響及其與EME1 mRNA表達水平的關(guān)系

3 討論

EME1位于17q21.33（第17號染色減數(shù)分裂結(jié)構(gòu)體長臂2區(qū)1帶3亞帶3次亞帶），可編碼蛋白質(zhì)。EME1蛋白可以與特定的DNA結(jié)構(gòu)相互作用，例如霍利迪連接體、3’末端翹翼（3’flap）結(jié)構(gòu)、異常復(fù)制叉結(jié)構(gòu)［10－11］，該蛋白可能影響DNA損傷修復(fù)并保持基因組穩(wěn)定性［4］。Weinandy等［12］發(fā)現(xiàn)原發(fā)性人膠質(zhì)細胞瘤中西妥昔單抗可以通過提高EME1的表達水平促進DNA修復(fù)，進而達到抗癌效用。EME1自身外顯子突變影響體內(nèi)EME1表達水平，中國南方女性的EME1 Ile350Thr變異與乳腺癌的易感性和早發(fā)顯著相關(guān)，其過度表達可導(dǎo)致乳腺癌的順鉑耐藥［13］。然而，目前EME1在子宮內(nèi)膜癌中的作用機制目前尚不明確。本研究利用生物信息學(xué)探索EME1與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性，為未來的機制探索提供研究基礎(chǔ)。

Tomoda等［14］對多種癌細胞株檢測發(fā)現(xiàn)，EME1低表達的腫瘤對化療藥敏感性更強，子宮內(nèi)膜癌細胞株AN3CA中EME1是高表達，但是并未檢測人子宮內(nèi)膜癌組織中EME1的表達狀況。UALCAN網(wǎng)站匯集了TCGA數(shù)據(jù)庫546例人子宮內(nèi)膜癌和35例人正常子宮內(nèi)膜樣本的mRNA測序數(shù)據(jù)，經(jīng)生物信息分析發(fā)現(xiàn)EME1 mRNA在子宮內(nèi)膜癌患者中高表達，其中漿液性子宮內(nèi)膜癌與混合型子宮內(nèi)膜癌中EME1 mRNA的表達水平高于子宮內(nèi)膜樣癌。進行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，EME1基因高表達與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后相關(guān)。利用蛋白質(zhì)相互作用原理，尋找與EME1蛋白關(guān)系最為密切的10個蛋白，進行富集分析。10個蛋白分別是BRCA1、TOP3A、RAD51、SLX4、ERCC4、MUS81、EXO1、RMI1、RMI2、BLM。BRCA1是一種同源重組修復(fù)蛋白，維持染色體穩(wěn)定性。Nahshon等［15］研究發(fā)現(xiàn)在BRCA1／2突變的人群中子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險增加2～3倍，子宮內(nèi)膜漿液性癌發(fā)病風(fēng)險增加12～13倍。BLM－TOP3A－RMI1／2溶解酶復(fù)合物與端粒延長替代通路中C環(huán)形成有關(guān)［16］。子宮內(nèi)膜癌患者BLM Ash雜合突變率高于正常人群［17］。EME1蛋白可以與MUS81蛋白組合成異源二聚體，發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性［18］。RAD51可抑制MUS81－EME1對DNA 3’末端翹翼的切割作用［19］。RAD51在各種腫瘤中過表達導(dǎo)致錯誤的DNA雙鏈修復(fù)，可促進腫瘤的進展與轉(zhuǎn)移。RAD51基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)［20］。SLX4蛋白是用于組裝SLX1－SLX4－MUS81－EME1－XPF－ERCC1（SMX）三核酸酶復(fù)合物的支架，SMX促進DNA 同源重組修復(fù)［21］。SLX4也可與XPFERCC4核酸內(nèi)切酶復(fù)合體的亞基結(jié)合，奠定DNA鏈間交聯(lián)損傷修復(fù)的基礎(chǔ)［22］。EXO1是一種DNA核酸外切酶，與雙鏈斷裂修復(fù)、錯配修復(fù)、端粒維持有關(guān)［23］。富集分析結(jié)果顯示它們主要涉及霍利迪連接體、DNA修復(fù)、范可尼貧血途徑等。富集分析的結(jié)果與EME1現(xiàn)有研究所揭露的功能是相符的。上述分析結(jié)果可為探索子宮內(nèi)膜癌中EME1的作用機制鋪墊基礎(chǔ)。

利用生物信息技術(shù)對EME1作用機制進行上游追溯，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細胞基因拷貝數(shù)增加與EME1高表達水平相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)EME1啟動子的潛在轉(zhuǎn)錄因子ESR1。ESR1可編碼雌激素受體α，經(jīng)生物信息分析發(fā)現(xiàn)，ESR1在子宮內(nèi)膜癌中低表達，與EME1表達呈負相關(guān)。根據(jù)現(xiàn)有分析結(jié)果進行推測：（1）高表達的ESR1可能對EME1啟動子有負性調(diào)控作用，抑制EME1的表達，當ESR1低表達時，對EME1的抑制減少；（2）生物信息分析結(jié)果基于現(xiàn)有研究，具有一定的局限性，可能ESR1與其他轉(zhuǎn)錄因子競爭性結(jié)合，進而抑制EME1的表達。未來可以借助染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)探索EME1的潛在轉(zhuǎn)錄因子。

綜上所述，圍繞EME1進行了生物信息學(xué)分析，挖掘了10個相關(guān)基因，1個潛在轉(zhuǎn)錄因子，為接下來EME1具體作用機制的研究奠定了基礎(chǔ)。同時也肯定了EME1與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性、重要性，展現(xiàn)了繼續(xù)深入研究的價值，為未來子宮內(nèi)膜癌患者的精準治療提供研究基礎(chǔ)。