楚倩，王云飛，程瑞瑞，李萍，王華啟

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450052）

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，近些年其病死率雖有下降的趨勢(shì)，但仍超過乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的總和［1］。根據(jù)組織病理學(xué)形態(tài)，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），NSCLC約占肺癌的85%，根據(jù)組織病理學(xué)形態(tài)又可分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等，其中腺癌是NSCLC最常見的類型［2］。由于缺乏早期臨床表現(xiàn)，很多肺腺癌患者確診時(shí)已處于疾病的晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。近些年來，針對(duì)驅(qū)動(dòng)基因突變的靶向治療和免疫治療可明顯改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量，但對(duì)于不存在任何驅(qū)動(dòng)基因突變的晚期肺腺癌患者，化療仍是此類患者治療的基石，而含鉑的雙藥化療仍為一線治療的標(biāo)準(zhǔn)方案。但臨床發(fā)現(xiàn)，很多肺腺癌患者在化療后會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，嚴(yán)重影響療效和預(yù)后［3－6］。鉑類藥物包括順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑等，可與DNA鏈交叉連接，造成DNA損傷，破壞DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是NSCLC的主要輔助治療，也可廣泛用于治療食管癌、膀胱癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤［7－8］。然而，鉑類藥物耐藥的出現(xiàn)仍然是NSCLC治療中的一大挑戰(zhàn)，更好地認(rèn)識(shí)NSCLC鉑類藥物耐藥的機(jī)制，將為逆轉(zhuǎn)鉑類藥物耐藥和提高NSCLC治療效果提供理論依據(jù)［9］，因此研究肺腺癌患者化療耐藥的相關(guān)機(jī)制已經(jīng)迫在眉睫。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是在轉(zhuǎn)錄過程中通過反向剪接形成的一段首尾相接的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)［10］。它最早于20世紀(jì)70年代在RNA病毒中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是“拼接噪音”或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并未引起人們太多的關(guān)注［11］。而近些年的研究表明，circRNA具有多種生物學(xué)功能，它既可以與蛋白質(zhì)相互作用，又可作為“分子海綿”，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微小RNA（microRNA，miRNA），阻止miRNA與相應(yīng)靶基因的3’－非翻譯區(qū)（3’－untranslated region，3’－UTR）結(jié)合，從而調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［12－13］。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在多種腫瘤組織中異常表達(dá)且與患者化療耐藥息息相關(guān)。Huang等［14］研究表明circular RNA AKT3是一種潛在的致癌因子，通過作用于相應(yīng)的信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，并且導(dǎo)致其對(duì)順鉑耐藥，成為潛在的治療靶點(diǎn)；Shen等［15］研究證實(shí)circular RNA Foxo3通過激活信號(hào)通路介導(dǎo)膀胱癌的進(jìn)展，并導(dǎo)致其對(duì)紫杉醇類藥物耐藥；Zhang等［16］研究發(fā)現(xiàn)circCELSR1可通過作用于miR－1252靶向調(diào)節(jié)FOXR2的表達(dá)，從而參與乳腺癌化療耐藥過程。

本研究通過circRNA高通量測(cè)序等技術(shù)篩選出差異表達(dá)的circ＿0000620，并探討其在肺腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，并且分析其與患者化療耐藥的相關(guān)性，為肺腺癌的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年1月至2020年1月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的120例肺腺癌患者的癌組織及其配對(duì)癌旁正常組織，經(jīng)手術(shù)或CT引導(dǎo)下肺穿刺獲取組織，標(biāo)本獲得后立即置于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱中保存。其中男73例，女47例，年齡≥55歲者71例，＜55歲者49例，化療耐藥者28例，化療敏感者92例。實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［17］：完全緩解（complete response，CR），所有腫瘤完全消失；部分緩解（partial response，PR），腫瘤最大徑縮小≥30%；病變穩(wěn)定（stable disease，SD），腫瘤最大徑變化介于PR和PD之間；病變進(jìn)展（progressive disease，PD），腫瘤最大徑增加≥20%或者有新轉(zhuǎn)移灶。將CR、PR視為化療敏感，SD、PD視為化療耐藥。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為肺腺癌；（2）手術(shù)前未接受過放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他部位的惡性腫瘤，（2）合并其他基礎(chǔ)疾病。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 材料與試劑肺腺癌細(xì)胞株A549、PC－9、SPC－A－1、NCI－H1299、NCI－H1395和正常人支氣管上皮細(xì)胞（normal human bronchial epithelial cell，NHBE）購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitation公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、qRT－PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；pGM－T載體、感受態(tài)大腸桿菌購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；circ＿0000620和內(nèi)參引物的合成以及測(cè)序技術(shù)由北京擎科生物科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 circRNA高通量測(cè)序 隨機(jī)選擇化療耐藥組的3對(duì)肺腺癌組織和癌旁正常組織的標(biāo)本，由上海鯨舟基因科技有限公司進(jìn)行RNA文庫制備和circRNA高通量測(cè)序，然后用EDGER軟件（http：／／bioconductor.org／）分析這3對(duì)標(biāo)本中circRNA的表達(dá)差異，并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)和生物信息分析，篩選出本次研究的目標(biāo)分子。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、含有體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549、PC－9、SPC－A－1、NCI－H1299、NCI－H1395和NHBE細(xì)胞。

1.3.3 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄 按照產(chǎn)品說明書使用RNA提取試劑盒Trizol提取肺腺癌組織、癌旁組織、肺腺癌細(xì)胞株和NHBE細(xì)胞的總RNA，再用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的濃度，讀取A260和A280處吸光度數(shù)值并計(jì)算A260與A280的比值，比值在1.7～2.0視為合格。接著按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real－time quantitative polymerase chain reaction，qRT－PCR）分別以cDNA、基因組DNA為模板，divergent primer、convergent primer為引物，按照PCR試劑盒的說明建立反應(yīng)體系，程序設(shè)定為94℃120 s，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)。以cDNA為模板，divergent primer為引物，按照qRT－PCR試劑盒的說明建立反應(yīng)體系，程序設(shè)定為94℃120 s，94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參基因，用2－△△Ct方法分析結(jié)果。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 分子克隆和測(cè)序 膠回收以cDNA為模板、divergent primer為引物擴(kuò)增出的目標(biāo)產(chǎn)物，然后重組入pGM－T載體，再轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌18～24 h，最后挑取陽性轉(zhuǎn)化菌送擎科公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRNA高通量技術(shù)篩選靶基因通過circRNA高通量測(cè)序技術(shù)共篩選出6 587個(gè)差異性表達(dá)的circRNA，有4 571個(gè)上調(diào)，2 016個(gè)下調(diào)，最主要的差異性表達(dá)見圖1。其中circ＿0000620的表達(dá)水平上調(diào)了8.2倍，位于15號(hào)染色體的AAGAB基因上，是由外顯子2、3、4、5反向剪切所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖1 肺腺癌組織及癌旁正常組織中circRNA的表達(dá)熱圖

2.2 circ＿0000620 在肺腺癌組織中存在且為circRNA第一，以cDNA和基因組DNA為模板，convergent primer為引物均可擴(kuò)出143 bp的產(chǎn)物條帶，以cDNA為模板，divergent primer為引物，可擴(kuò)增出361 bp的產(chǎn)物條帶，而以基因組DNA為模版，divergent primer為引物則不能擴(kuò)增出361 bp的產(chǎn)物條帶（圖2）。第二，利用circBase（http：／／www.circbase.org／）在UCSC Genome Browser（http：／／genome.ucsc.edu／）中探索了circ＿0000620的形成過程，發(fā)現(xiàn)它位于15號(hào)染色體上，是由AAGAB基因組的外顯子2、3、4、5環(huán)化所形成的，并通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物中存在反向剪接（backsplice junction，BS）位點(diǎn)（圖3）。第三，BLAST結(jié)果顯示：BS位點(diǎn)前的部分序列為AAGAB基因的5號(hào)外顯子（圖4B），BS位點(diǎn)后的部分序列為AAGAB基因的2號(hào)外顯子（圖4A），將包含BS位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行BLAST，無相關(guān)結(jié)果（圖4C）。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖3 circ＿0000620測(cè)序結(jié)果

圖4 BLAST結(jié)果

2.3 肺腺癌組織和細(xì)胞株中circ＿0000620的表達(dá)水平肺腺癌組織中circ＿0000620的表達(dá)水平高于其配對(duì)癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。肺腺癌細(xì)胞株（A549、PC－9、SPC－A－1、NCI－H1299、NCI－H1395）中circ＿0000620的表達(dá)水平也高于NHBE，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖5 肺腺癌組織與癌旁正常組織中circ＿0000620的表達(dá)水平

圖6 肺腺癌細(xì)胞株中circ＿0000620的表達(dá)水平

2.4 肺腺癌組織中circ＿0000620的表達(dá)水平與化療耐藥的相關(guān)性分析分析28例化療耐藥和92例化療敏感患者肺腺癌組織中circ＿0000620的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：化療耐藥組肺腺癌組織中circ＿0000620的表達(dá)水平高于化療敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖7）。不同性別、不同年齡組肺腺癌組織中circ＿0000620的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖8、9。

圖7 肺腺癌組織中circ＿0000620的表達(dá)水平在化療敏感組與化療耐藥組中的差異

圖8 肺腺癌組織中circ＿0000620的表達(dá)水平在性別中的差異

圖9 肺腺癌組織中circ＿0000620的表達(dá)水平在年齡中的差異

3 討論

circRNA屬于非編碼RNA（non－coding RNA，ncRNA）的一種，可存在于多種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，雖不直接編碼蛋白質(zhì)，但可在DNA轉(zhuǎn)錄、RNA加工和蛋白質(zhì)翻譯水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［18］。研究表明，circRNA主要位于細(xì)胞核中，由外顯子反向剪接所形成的具有BS位點(diǎn)的circRNA，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA不具備5’端帽子和3’端的尾巴結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶RNase R降解，在體內(nèi)穩(wěn)定存在，并可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［19］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)circRNA不僅促進(jìn)了腫瘤的惡性過程，還與化療耐藥息息相關(guān)。例如：Kong等［20］研究表明，hsa＿circ＿0085131在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，用不同濃度的順鉑處理NSCLC細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)hsa＿circ＿0085131在順鉑耐藥的細(xì)胞株中高表達(dá)，并且通過蛋白質(zhì)印記等實(shí)驗(yàn)表明hsa＿circ＿0085131可通過影響細(xì)胞自噬導(dǎo)致NSCLC對(duì)順鉑耐藥；Zhao等［21］研究表明，circRNA CDR1as在順鉑耐藥的NSCLC細(xì)胞株中高表達(dá)，并且通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明circRNA CDR1as可與miR－641結(jié)合調(diào)控HOXA9的表達(dá)，從而參與NSCLC化療耐藥過程；Xu等［22］研究表明，circAKT3在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，并可通過調(diào)節(jié)miR－516b－5p／STAT3軸介導(dǎo)的糖酵解平衡來抑制肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

在本研究中，采用circRNA高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在化療耐藥的3對(duì)癌組織和癌旁組織中circ＿0000620的表達(dá)顯著上調(diào)，而circ＿0000620在腫瘤組織中的作用還未被報(bào)道，因此選擇circ＿0000620作為研究的目標(biāo)分子。circ＿0000620位于15號(hào)染色體上，是由AAGAB基因組的外顯子2、3、4、5環(huán)化所形成的，并通過divergent primer和測(cè)序技術(shù)證明了其在肺腺癌組織中存在且為環(huán)狀。目前，基于鉑類的化療方案仍是非小細(xì)胞肺癌患者的基本抗癌策略之一，利用qRTPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)circ＿0000620在肺腺癌組織和細(xì)胞株中高表達(dá)，并且通過比較不同分組中circ＿0000620的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)circ＿0000620的表達(dá)在化療耐藥組水平高于化療敏感組，而性別、年齡中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。關(guān)于circ＿0000620導(dǎo)致患者化療耐藥的具體作用機(jī)制，將在接下來的研究中做出進(jìn)一步的探討。

綜上所述，circ＿0000620在肺腺癌組織中顯著高表達(dá)，并且在患者化療耐藥組中水平更高，因此，circ＿0000620可作為潛在的分子靶點(diǎn)，對(duì)提高化療效果、改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量具有非常重要的意義。