袁 源，閻熠晗，吳福泉，張鳳培，黃海辰，吳小平，傅俊生

(福建農(nóng)林大學(xué) a生命科學(xué)學(xué)院，b菌物研究中心，福建 福州 350002)

黑木耳(Auriculariaheimuer)又名光木耳，隸屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬[1]。迄今為止，黑木耳在我國(guó)的人工栽培歷史已有1 400多年，廣泛分布于東北、西南和東南等地區(qū)，現(xiàn)已成為我國(guó)第二大食用菌栽培品種，其產(chǎn)量?jī)H次于香菇[2-3]。其富含多糖、蛋白質(zhì)、黃酮和黑色素等活性成分，有益于人體健康，具有較大的開發(fā)和應(yīng)用潛能[4]。其中，黑色素是一種呈深褐色至黑色的天然生物色素，通常是由吲哚、酚和羥基萘酚等環(huán)狀亞單位形成的聚合物，普遍存在于動(dòng)物、植物和原生生物中[5]。研究表明，天然黑色素具有良好的抗氧化、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)和保肝活性[6-9]等功能。因此，高效提取黑木耳黑色素具有重要的實(shí)用意義。

酶法提取工藝是一種有效的提取方法，能迅速破壞細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的溶出，以提高活性物質(zhì)的提取效率，具有反應(yīng)條件溫和、特異性和高效性等特點(diǎn)[10]。復(fù)合酶協(xié)同提取工藝則是通過結(jié)合2種及以上的酶破壞細(xì)胞的多個(gè)結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的高效提取[11-12]。黑木耳中含有豐富的纖維素和果膠，用復(fù)合酶提取能有效促使細(xì)胞壁破裂，加速活性成分大量浸出，研究人員使用超聲波輔助纖維素酶和木瓜蛋白酶顯著提高了黑木耳多糖的提取得率[13-14]。但目前尚未見有關(guān)復(fù)合酶協(xié)同提取黑色素的相關(guān)報(bào)道，故本研究探究了復(fù)合酶提取黑木耳黑色素的條件，并對(duì)優(yōu)化條件下提取的黑色素進(jìn)行表征和抗氧化活性分析，以期為黑木耳黑色素產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材 料 黑木耳新品種‘農(nóng)黑2號(hào)’(編號(hào)2020004)由福建省種子總站鑒定。

1.1.2 試劑和儀器 氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵和過氧化氫等均為國(guó)產(chǎn)分析純。纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、二苯基苦味?；诫?DPPH)、2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)、維生素C，均購(gòu)于Solarbio公司。

所用儀器：YF8-1多功能粉碎機(jī)(浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)、JA2003B電子天平(上海基平科學(xué)儀器有限公司)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)、ST16R型離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)和FE-20型pH計(jì)(梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2 黑色素的提取

參考侯若琳等[6]的方法，并稍加修改。將黑木耳子實(shí)體干品打磨成粉末，過孔徑0.15 mm標(biāo)準(zhǔn)篩，準(zhǔn)確稱取1 g黑木耳子實(shí)體粉末，在特定溫度、復(fù)合酶質(zhì)量比、酶添加量、酶解pH、液(mL)料(g)比和酶解溫度的酶解液中反應(yīng)一段時(shí)間，然后10 000 r/min下離心3 min取沉淀。其中，纖維素酶溶于pH為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液，果膠酶和木瓜蛋白酶溶于水。按照1∶40的液料比將沉淀充分溶于1 mol/L NaOH溶液，反應(yīng)1 h后10 000 r/min下離心3 min取上清。使用6 mol/L HCl調(diào)上清pH為1.5～2.0，置于80 ℃條件下水浴10 h，水浴結(jié)束后10 000 r/min下離心3 min獲得沉淀即為黑色素粗品。將沉淀依次用去離子水、氯仿、乙酸乙酯、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和去離子水反復(fù)洗滌3次，6 000 r/min離心3 min獲得沉淀。最后，用0.1 mol/L NaOH將沉淀復(fù)溶，再用0.1 mol/L HCl將提取液pH調(diào)至中性，流水透析48 h后，真空冷凍干燥即得黑木耳黑色素純品。黑木耳黑色素提取得率的計(jì)算公式為：

提取得率=黑色素粗品質(zhì)量/子實(shí)體粉末質(zhì)量×100%。

1.3 紅外全吸收光譜的測(cè)定

參照李琦等[15]的方法，將純化的黑木耳黑色素和溴化鉀粉末按照1∶200的質(zhì)量比研磨為細(xì)粉進(jìn)行壓片，在500～4 000 cm-1內(nèi)測(cè)定其紅外吸收光譜。

1.4 單一酶單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g黑木耳子實(shí)體粉末，在酶解pH 4.5，液料比10∶1，酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間60 min的條件下，分別進(jìn)行纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶用量(均設(shè)0,5,10,15,20,25 mg/g)3個(gè)因素的單因素試驗(yàn)，以黑木耳黑色素提取得率為指標(biāo)，探究各種酶對(duì)黑色素提取得率的影響，確定酶的最佳用量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5 復(fù)合酶單因素試驗(yàn)

基于單一酶最佳用量，準(zhǔn)確稱取1 g黑木耳子實(shí)體粉末，以黑木耳黑色素提取得率為指標(biāo)，依次探究纖維素酶/果膠酶/木瓜蛋白酶質(zhì)量比、復(fù)合酶添加量、酶解pH、液料比、酶解溫度和酶解時(shí)間6個(gè)因素，對(duì)黑色素提取得率的影響，確定各因素的最佳水平。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5.1 復(fù)合酶質(zhì)量比 在酶解pH 4.5、液料比10∶1、酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間60 min、酶添加量15 mg/g的條件下，探究纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶三者質(zhì)量比(0∶0∶0，1∶0∶1，0∶1∶1，1∶1∶0，1∶1∶1，2∶1∶0，2∶0∶1，1∶2∶0，1∶0∶2，0∶1∶2，0∶2∶1，1∶3∶0，1∶0∶3，3∶0∶1，3∶1∶0，0∶3∶1，0∶1∶3，1∶1∶2，1∶2∶1，2∶1∶1)對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響。

1.5.2 復(fù)合酶添加量 在酶解pH 4.5、液料比10∶1、酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間60 min、酶質(zhì)量比1∶3∶0的條件下，探究復(fù)合酶添加量(0，5，10，15，20，25，30 mg/g)對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響。

1.5.3 酶解pH 在液料比10∶1、酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間60 min、酶質(zhì)量比1∶3∶0、復(fù)合酶添加量25 mg/g的條件下，探究酶解pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響。

1.5.4 液料比 在酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間60 min、酶質(zhì)量比1∶3∶0、復(fù)合酶添加量25 mg/g、酶解pH為5.5的條件下，探究液料比(10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1)對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響。

1.5.5 酶解溫度 在酶解時(shí)間60 min、酶質(zhì)量比1∶3∶0、復(fù)合酶添加量25 mg/g、酶解pH 5.5、液料比20∶1的條件下，探究酶解溫度(30，35，40，45，50，55 ℃)對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響。

1.5.6 酶解時(shí)間 在酶質(zhì)量比1∶3∶0、復(fù)合酶添加量25 mg/g、酶解pH為5.5、酶解液料比20∶1、酶解溫度35 ℃的條件下，探究酶解時(shí)間(20，40，60，80，100，120 min)對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響。

1.6 酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken中心組合原理，采用Design-expert11軟件對(duì)復(fù)合酶單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。以黑木耳黑色素提取得率為響應(yīng)值，對(duì)酶添加量、酶解pH和酶解溫度3個(gè)變量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以獲得復(fù)合酶提取黑木耳黑色素的最優(yōu)條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 黑木耳黑色素提取的Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test of melanin extraction from Auricularia heimuer

1.7 黑木耳黑色素的抗氧化活性測(cè)定

1.7.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力 參照侯若琳等[6]的方法并稍作修改，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。吸取100 μL 2×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液和100 μL黑木耳黑色素溶液(0.05，0.25，0.5，1，2，5 mg/mL)于96孔板，混勻后避光室溫保存30 min，于517 nm下測(cè)定吸光度AX。同時(shí)，將黑色素溶液和DPPH無水乙醇溶液分別替換為等體積的蒸餾水，測(cè)吸光度A0和AX0，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算自由基清除率。

1.7.2 對(duì)ABTS自由基的清除能力 參照Miller等[16]的方法并稍作修改，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。吸取100 μL ABTS+工作液和100 μL黑木耳黑色素溶液(0.05，0.25，0.5，1，2，5 mg/mL)于96孔板，混勻后避光室溫保存20 min，于734 nm下測(cè)定吸光度AX。將黑色素溶液和ABTS+工作液分別替換為等體積的蒸餾水，測(cè)吸光度A0和AX0，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算自由基清除率。

1.7.3 對(duì)OH自由基的清除能力 參照白生文等[17]的方法并稍作修改，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。吸取15 μL黑木耳黑色素溶液(0.05，0.25，0.5，1，2，5 mg/mL)、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L的FeSO4溶液和8.8 mmol/L的H2O2溶液于96孔板，再滴加165 μL蒸餾水使其充分混勻，于37 ℃保存15 min，在510 nm下測(cè)定吸光度AX，將黑色素溶液和H2O2分別替換為等體積的蒸餾水，測(cè)吸光度A0和AX0，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算自由基清除率。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

自由基清除率=[1-(AX-AX0)/A0]×100%。

數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 25.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。采用SPSS 25.0軟件計(jì)算半數(shù)清除濃度(EC50值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一酶對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響

2.1.1 纖維素酶的影響 纖維素酶添加量對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響如圖1-A所示，在一定用量范圍內(nèi)，黑木耳黑色素的提取得率隨纖維素酶用量的增加而升高，添加15 mg/g纖維素酶時(shí)黑木耳黑色素提取得率最高，之后下降，表明添加15 mg/g纖維素酶提取黑木耳黑色素比較合適。

2.1.2 果膠酶的影響 果膠酶添加量對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響如圖1-B所示，在一定用量范圍內(nèi)，黑木耳黑色素的提取得率隨果膠酶用量的增加而升高，當(dāng)果膠酶添加量為15 mg/g時(shí)，黑木耳黑色素提取得率極顯著提高，繼續(xù)加大果膠酶用量，黑木耳黑色素提取得率趨于穩(wěn)定，表明添加15 mg/g果膠酶提取黑木耳黑色素比較適宜。

2.1.3 木瓜蛋白酶的影響 木瓜蛋白酶添加量對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響如圖1-C所示，在一定用量范圍內(nèi)，黑木耳黑色素的提取得率與木瓜蛋白酶用量呈正相關(guān)，當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為10 mg/g時(shí)，黑木耳黑色素提取得率極顯著提高，繼續(xù)加大木瓜蛋白酶用量時(shí)，黑木耳黑色素提取得率無明顯變化，表明添加10 mg/g果膠酶提取黑木耳黑色素比較適宜。

2.2 復(fù)合酶單因素對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響

2.2.1 復(fù)合酶質(zhì)量比的影響 復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)黑色素提取得率的影響如圖2-A所示，與對(duì)照組(0∶0∶0)相比，當(dāng)纖維素酶/果膠酶/木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1∶3∶0時(shí)，黑木耳黑色素提取得率最高，表明采用纖維素酶/果膠酶/木瓜蛋白酶質(zhì)量比為1∶3∶0,即用纖維素酶和果膠酶配合提取黑木耳黑色素比較適宜。

2.2.2 復(fù)合酶添加量的影響 復(fù)合酶添加量對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響如圖2-B所示，在一定用量范圍內(nèi)，黑色素的提取得率與復(fù)合酶添加量呈正相關(guān)，添加15，20，25，30 mg/g復(fù)合酶均極顯著提高了黑色素的提取得率。當(dāng)復(fù)合酶添加量為25 mg/g時(shí)，黑色素提取得率最高，之后下降，表明添加25 mg/g復(fù)合酶提取黑木耳黑色素比較適宜。

2.2.3 酶解pH的影響 酶解pH對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響如圖2-C所示，在一定酶解pH范圍內(nèi)，黑色素提取得率隨pH的提高呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)pH為5.5時(shí)，黑色素的提取得率最高，表明pH為5.5提取黑木耳黑色素比較適宜。

2.2.4 液料比的影響 液料比對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響如圖2-D所示，在一定液料比范圍內(nèi)，黑色素提取得率與液料比呈正相關(guān)，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，黑色素提取得率最高，之后下降，表明液料比20∶1提取黑木耳黑色素比較適宜。

2.2.5 酶解溫度的影響 酶解溫度對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響如圖2-E所示，黑木耳黑色素提取得率隨著酶解溫度的升高呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為35 ℃時(shí)，黑色素的提取得率最高，酶解溫度繼續(xù)升高時(shí)提取得率開始下降，可能是因?yàn)楦邷貢?huì)抑制酶活性。表明酶解溫度為35 ℃提取黑木耳黑色素比較適宜。

2.2.6 酶解時(shí)間的影響 酶解時(shí)間對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響如圖2-F所示，酶解60 min時(shí)黑木耳黑色素提取得率最高，極顯著高于其他處理，隨后逐漸下降，可能是因?yàn)?0 min時(shí)酶與底物已基本完成反應(yīng)。表明酶解時(shí)間設(shè)為60 min提取黑木耳黑色素比較適宜。

2.3 黑木耳黑色素復(fù)合酶提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取酶添加量(A)、酶解pH(B)和酶解溫度(C)為自變量，以黑木耳黑色素提取得率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

2.3.2 回歸方程的建立 使用Desig-expert11軟件對(duì)黑木耳黑色素得率(表2)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到A、B和C3個(gè)因素實(shí)際值與Y之間的回歸方程為Y=13.66+0.31A+0.31B+0.25C+0.05AB-0.18AC-0.18BC-0.88A2-0.68B2-0.61C2。

表2 黑木耳黑色素復(fù)合酶提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Table 2 Results of response surface optimization of extraction conditions of melanin complex enzyme from Auricularia heimuer

通過對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析(表3)發(fā)現(xiàn)該模型P<0.01，說明具有極顯著性。由該回歸方程R2=0.947 1，可知模型擬合度較好，可以準(zhǔn)確反映各單因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。模型的一次項(xiàng)A、B、C影響顯著(P<0.05)，二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著(P<0.01)。同時(shí)，回歸方程的失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸方程與實(shí)際值比較吻合，誤差較小，可用此回歸方程分析和預(yù)測(cè)黑木耳黑色素的最佳提取條件。

表3 黑木耳黑色素復(fù)合酶提取條件優(yōu)化結(jié)果的回歸模型方差分析和顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression model of variance analysis and significance tests for extracting optimization results of melanin complex enzyme from Auricularia heimuer

2.3.3 雙因素交互作用 3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)黑木耳黑色素提取得率的影響響應(yīng)面分析結(jié)果(圖3)顯示，3個(gè)曲面陡峭，表明酶添加量與酶解pH、酶解pH與酶解溫度及酶添加量與酶解溫度之間的交互作用雖不具顯著性，但有一定差異。

(1)酶添加量與酶解pH的交互作用。圖3-A，B為酶解溫度35 ℃時(shí)，酶添加量與酶解pH對(duì)黑木耳黑色素提取得率影響的響應(yīng)面和等高線圖。由圖3-A可知，酶添加量在20～30 mg/g，酶解pH在5.0～6.0時(shí)，黑色素提取得率呈先增后減的趨勢(shì)。酶添加量曲面較酶解pH曲面平緩，說明酶添加量對(duì)黑色素提取得率的影響較大。

(2)酶解pH與酶解溫度的交互作用。圖3-C,D為酶添加量25 mg/g時(shí)，酶解pH與酶解溫度對(duì)黑色素提取得率影響的響應(yīng)面和等高線圖。由圖3-C可知，酶解pH在5.0～6.0，酶解溫度在30～40 ℃時(shí)，黑色素提取得率呈先增后減的趨勢(shì)。酶解pH曲面較酶解溫度曲面平緩，說明酶解pH對(duì)黑色素提取得率的影響較大。

(3)酶添加量與酶解溫度的交互作用。圖3-E,F為酶解pH為5.5時(shí)，酶添加量與酶解溫度對(duì)黑色素提取得率影響的響應(yīng)面和等高線圖。由圖3-E可知，酶添加量在20～30 mg/g，酶解溫度在30～40 ℃時(shí)，黑色素提取得率呈先增后減的趨勢(shì)。酶添加量曲面較酶解溫度曲面平緩，說明酶添加量對(duì)黑色素提取得率的影響較大。

綜上可知，酶添加量對(duì)黑木耳黑色素提取得率影響最大，其次為pH,酶解溫度影響相對(duì)較小，與方差分析結(jié)果一致。

2.3.4 優(yōu)化條件驗(yàn)證 預(yù)測(cè)該模型的最優(yōu)提取條件為：復(fù)合酶添加量25 mg/g，酶解pH 5.96，酶解溫度32.68 ℃，在此條件下，黑色素提取得率可達(dá)到13.20%。為了對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，并且便于操作，實(shí)際提取條件為：復(fù)合酶添加量25 mg/g，酶解pH 6.0，酶解溫度33 ℃，對(duì)黑木耳黑色素進(jìn)行3次提取驗(yàn)證，實(shí)際提取得率為13.80%。在25 mg/g酶添加量下，該提取得率分別是纖維素酶(6.80%)、果膠酶(7.25%)和木瓜蛋白酶(10.13%)(圖1)單一處理組的2.03，1.90和1.36倍。

2.4 黑木耳黑色素的紅外光譜

用紅外吸收光譜對(duì)天然黑色素進(jìn)行分析和鑒定，能有效對(duì)其化學(xué)鍵進(jìn)行表征。如圖4所示，復(fù)合酶提取的黑木耳黑色素紅外光譜中，3 298.40 cm-1處有強(qiáng)而寬的吸收峰，表明存在-NH和-OH結(jié)構(gòu)；2 926.13cm-1處的尖峰對(duì)應(yīng)脂肪族C-H基團(tuán)，表明有CH2CH3存在；1 652.71 cm-1處的特征吸收對(duì)應(yīng)于C=O伸縮振動(dòng)或芳香環(huán)的C=C伸縮振動(dòng)；1 540.00 cm-1處的N-H彎曲振動(dòng)和1 402.39 cm-1的C-N伸縮振動(dòng)，表明該黑色素具有典型的黑色素吲哚結(jié)構(gòu)；627.45 cm-1處吸收帶較弱，意味著芳香環(huán)已被取代形成共軛體系。

2.5 黑木耳黑色素的抗氧化活性

如圖5所示，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，黑木耳黑色素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH、ABTS和OH自由基的清除能力呈劑量依賴性。其中，黑木耳黑色素對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除效果較好，其EC50值分別為1.62，0.99 mg/mL。同時(shí)，黑木耳黑色素對(duì)OH自由基的EC50值為4.44 mg/mL。當(dāng)黑色素質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除率與VC無顯著差異，高達(dá)(98.95±2.08)%，表明復(fù)合酶提取的黑木耳黑色素具有良好的抗氧化活性。

3 討論與結(jié)論

黑色素通常只溶于堿性溶液，傳統(tǒng)上一般采用堿溶酸沉法提取[15]，但存在提取得率低、提取周期長(zhǎng)等問題。為提高黑木耳黑色素的提取效率，李琦等[15]采用堿提法對(duì)黑木耳黑色素進(jìn)行提取，獲得黑色素粗品得率2.26%。張蓮姬等[24]采用鹽酸浸提法提取獲得的黑色素得率為2.70%；李琦[25]又采用超聲法輔助氫氧化鈉提取法，最終黑色素得率為9.10%；張艷榮等[26]采用碳酸鈉提取，得到黑木耳黑色素粗提物得率為9.078%；宋丹靚敏等[27]采用超聲微波輔助提取黑木耳黑色素，黑色素得率為9.10%；侯若琳等[6]采用纖維素酶輔助超聲波提取法提取黑木耳黑色素，得率為10.48%。本試驗(yàn)采用復(fù)合酶提取黑木耳黑色素，其操作簡(jiǎn)單，周期較短，提取效率高。響應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取參數(shù)為：纖維素酶/果膠酶/木瓜蛋白酶復(fù)合酶添加量25 mg/g，酶解pH 6.0，酶解溫度33 ℃，三者酶質(zhì)量比1∶3∶0，液料比20∶1，酶解時(shí)間60 min。在此條件下，黑色素實(shí)際提取得率可提高至13.80%，表明纖維素酶和果膠酶協(xié)同提取黑木耳黑色素能有效促使黑木耳細(xì)胞壁破裂，加速黑色素大量浸出，具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用潛力。

綜上，纖維素酶協(xié)同果膠酶提取可以顯著提高黑木耳黑色素得率，其得率高達(dá)13.80%。同時(shí)，所得黑色素具有良好的抗氧化活性，該方法可用于高效提取黑木耳黑色素。