卞春安 田曉奇 林超宇 許里

肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)第二大組織學(xué)亞型，不同于肺腺癌，各類針對驅(qū)動基因的TKI及免疫治療藥物在肺鱗癌中進(jìn)展緩慢，晚期肺鱗癌病人的5年生存率小于15%，總體預(yù)后不佳[1-2]。 小熱休克蛋白(sHsps)是一個龐大的蛋白家族，人類基因組包含10個編碼sHsps的基因[3]。其中HspB4(CRYAB)在多種細(xì)胞類型中出現(xiàn)異常表達(dá)并可針對凋亡刺激、氧化應(yīng)激等情況調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。多項研究指出，CRYAB在乳腺癌、頭頸腫瘤、膠質(zhì)瘤、卵巢癌中同樣存在異常表達(dá)及其并與腫瘤的多種惡性生物學(xué)行為顯著相關(guān)[4-5]。我們首先采用qPCR法檢測20例肺鱗癌組織中的CRYAB mRNA的表達(dá)水平，初步證實了CRYAB在肺鱗癌組織中為高表達(dá)，進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)法檢測了59例肺鱗癌組織芯片中的CRYAB蛋白的表達(dá)情況，結(jié)合相應(yīng)病人的臨床病例資料，探討CRYAB表達(dá)水平與肺鱗癌病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

標(biāo)本來源：肺鱗癌病人組織標(biāo)本20例，為2014年1月～2016年12月收治的肺鱗癌手術(shù)病人。免疫組化實驗的59例肺鱗癌病人組織芯片購買于上海芯超生物科技有限公司[6]。

肺鱗癌病人組織芯片59例， 男性54例，女性5例，年齡60～78歲；腫瘤直徑≥3 cm 56例，<3 cm 3例；病理類型Ⅰ～Ⅱ級43例，Ⅲ～Ⅳ級16例；脈管侵犯4例；淋巴結(jié)陽性24例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移1例。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期21例。隨訪時間為1～91個月，平均46.8個月。見表1。

表1 CRYAB表達(dá)與59例肺鱗癌病人臨床病理特征關(guān)系(例)

二、方法

1.主要試劑 Trizol購自于Invitrogen公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，CRYAB抗體購自Abcam公司(Abcam,Cambridge,MA,USA)，免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(BOSTER,Wuhan,China)。

2.RNA提取根據(jù)Trizol試劑盒說明步驟進(jìn)行[7]。CRYAB引物序列如下:正向 5'-CTT TGA CCA GTT CTT CGG AG-3' ，反向 5'-CCT CAA TCA CAT CTC CCA AC-3';內(nèi)參基因GAPDH的引物序列如下：正向5'-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3'，反向 3'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-5'。

3.SP免疫組化檢測按照所采購的試劑盒說明書進(jìn)行[8]。通過免疫組化評分(immunohistochemical scores，IHS)進(jìn)行判讀，以陽性細(xì)胞數(shù)≤10%判定為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)>10%判定為陽性。免疫組化的結(jié)果判定由兩個高年資病理科醫(yī)生共同作出。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1.20例癌和對應(yīng)癌旁組織中CRYAB mRNA表達(dá)情況見圖1。結(jié)果顯示，癌組織和癌旁組織CRYAB mRNA表達(dá)分別為4.456±1.5120和(2.944±0.4907，兩組比較其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 CRYAB mRNA在肺鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

2.免疫組化檢測：免疫組化結(jié)果顯示，59例肺鱗癌病人中，有23例(38.98%)CRYAB蛋白高表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿(圖2)；對應(yīng)的癌旁正常組織病例僅有8例(13.56%)顯示CRYAB蛋白高表達(dá)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 CRYAB在肺鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)(SP×400)

3.CRYAB表達(dá)與肺鱗癌臨床病理特征的關(guān)系：CRYAB的表達(dá)與LUSC臨床指標(biāo)中T分期顯著相關(guān)(P<0.05)。見表1。

4.生存分析：單因素分析顯示，CRYAB的表達(dá)及T分期與病人的總生存期有關(guān)(P<0.05)。進(jìn)一步多因素Cox回歸分析證實，CRYAB的表達(dá)和T分期是肺鱗癌病人的獨立預(yù)后因素(P<0.05)，見表2。Kaplan-Meier生存曲線顯示，肺鱗癌病人中高表達(dá)CRYAB的預(yù)后不佳(圖3)。

表2 單因素及多因素Cox回歸分析預(yù)后相關(guān)因素

圖3 CRYAB及腫瘤直徑與病人總生存期的關(guān)系

討論

CRYAB最初被發(fā)現(xiàn)存在于眼球晶狀體中，同樣也在身體的其他部位，例如心臟，骨骼肌，卵巢等有表達(dá)[9]。CRYAB可作為分子伴侶，在細(xì)胞遇到外在壓力如輻射和過氧化時，抑制細(xì)胞聚集，防止細(xì)胞變性，促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡[10]。近年來，CRYAB與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸引起關(guān)注[4]。CRYAB可在多種惡性腫瘤異常表達(dá)，如頭頸腫瘤、乳腺癌、肝癌、腎細(xì)胞癌[11-14]；CRYAB可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為[15]；CRYAB高表達(dá)的腫瘤病人預(yù)后不佳[10]。而關(guān)于CRYAB在腫瘤中的作用機制研究亦逐漸深入，Huang等[16]報道，CRYAB可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過激活ERK1/2/Fra-1/slug信號通路介導(dǎo)索拉非尼耐藥；Guo等[17]報道CRYAB可影響M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化并促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移；Ruan等[18]報道，CRYAB可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)并誘發(fā)乳腺癌抗血管治療抵抗作用。

本研究首先收集了20例肺鱗癌病人的腫瘤組織及對應(yīng)癌旁組織，通過qPCR檢測，了解CRYAB mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CRYAB mRNA在肺鱗癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；我們進(jìn)一步使用免疫組化法檢測了包含59例肺鱗癌標(biāo)本及其對應(yīng)癌旁標(biāo)本的組織芯片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRYAB在肺鱗癌組織中的異常高表達(dá)。采用單因素及多因素風(fēng)險回歸模型分析59例肺鱗癌病人預(yù)后相關(guān)因素。單因素分析提示，CRYAB表達(dá)及T分期是預(yù)后不良指標(biāo)；多因素分析表明，CRYAB高表達(dá)及T分期是肺鱗癌的不良預(yù)后的獨立影響因素。以上結(jié)果均與關(guān)于CRYAB的多項研究結(jié)果相符，均提示CRYAB的“促腫瘤”特性并與預(yù)后不佳顯著相關(guān)[7,10-11,15]。有研究表明，CRYAB在鼻咽癌中還可發(fā)揮“抑制腫瘤”作用，且CRYAB的表達(dá)和頭頸部鱗癌預(yù)后無關(guān)[19-20]。這說明CRYAB在不同類型腫瘤發(fā)生發(fā)展中功能的多樣性及復(fù)雜性。本實驗樣本量偏少，后續(xù)仍需收集更多的樣本，以期獲得更加可靠的實驗數(shù)據(jù)。

綜上所述，CRYAB在肺鱗癌組織中異常高表達(dá)，CRYAB的表達(dá)水平和肺鱗癌的腫瘤直徑是肺鱗癌預(yù)后的獨立危險因素。CRYAB標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，可為肺鱗癌的診療提供新的研究方向。