楊剛 王冠 熊永福 李蕓 雷蓉 柳彌

肝癌是全球癌癥死因的第二大原因,占原發(fā)性肝癌的70%～90%[1-2]。深入研究肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)對(duì)改善肝癌病人預(yù)后至關(guān)重要[3-4]。 TP53調(diào)控細(xì)胞凋亡抑制因子1(TRIAP1)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有抑制凋亡作用的9k-Da的蛋白質(zhì)[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TRIAP1可以與進(jìn)化和淋巴相關(guān)的蛋白(PRELI)形成復(fù)合體，通過調(diào)控心磷脂抑制凋亡[7]。 有研究顯示，TRIAP1可通過與熱休克蛋白70(HSP70)相互作用，阻止凋亡蛋白酶激活因子1(APAF1)、細(xì)胞色素C和Caspase 9形成凋亡復(fù)合物,調(diào)節(jié)凋亡通路[8]。TRIAP1也在多個(gè)研究中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，腫瘤組織中TRIAP1表達(dá)較癌旁組織明顯上調(diào)，且與病人生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[5,9]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證腫瘤組織與正常組織中TRIAP1表達(dá)差異，利用siRNA沉默方法探究TRIAP1對(duì)肝癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

Huh7、HepG2人肝癌細(xì)胞系、siTRIAP1小干擾RNA等。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞株Huh7和HepG2分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合物的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，根據(jù)生長情況每2～3天進(jìn)行細(xì)胞換液或消化傳代處理。

2.細(xì)胞總RNA的提取以及TRIAP1 mRNA相對(duì)水平的測定：RNA的提取和TRIAP1相對(duì)水平的測定參考試劑商提供的產(chǎn)品說明書。

3.細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染構(gòu)建敲低TRIAP1細(xì)胞系：使用上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司提供的siTRIAP1小干擾RNA及對(duì)照，分別對(duì)人肝癌細(xì)胞株Huh7和HepG2兩種細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)上述供應(yīng)商提供的說明書轉(zhuǎn)染Huh7和HepG2細(xì)胞系。具體操作如下：細(xì)胞生長至50%時(shí)，使用Opti-MEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理2小時(shí)，將轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、小干擾RNA分別與Opti-MEM混合均勻，轉(zhuǎn)染體系為2 ml/孔，分別取125 μl Opti-MEM培養(yǎng)基與5 μl Lipo2000和5 μl siRNA混合，靜置5分鐘后將兩種體系混合均勻，靜置20分鐘，加入培養(yǎng)皿，4～6小時(shí)后更換完全培養(yǎng)基。48～72小時(shí)收獲細(xì)胞提取蛋白，用于Western blot印跡實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染效率。

4.CCK8細(xì)胞檢測：利用胰酶將處于對(duì)數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞消化至無菌離心管，離心后加以RPMI1640培養(yǎng)基重新吹打均勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以 2×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，按照時(shí)間梯度，分別在0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)時(shí)每孔加入10 μl CCK8試劑，繼續(xù)孵育1小時(shí)后，酶標(biāo)儀450 nm檢測其每孔OD值，以上實(shí)驗(yàn)過程重復(fù)3次，使用GraphPad 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖。

5.Western blot印跡檢測 ：提取貼壁細(xì)胞蛋白后，參考之前的研究進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)[8]。

6.Annex inV/PI法檢測細(xì)胞凋亡：細(xì)胞鋪板(以六孔板為例):收取細(xì)胞進(jìn)行鋪板，每孔接種5×109個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，使用PKA激活劑FI,抑制劑H89,KT5720處理細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24小時(shí)。胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞5×105/ml～1×106/ml。使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞，1 000 prm,4 ℃離心5分鐘,3次。加入凋亡binding buffer重懸細(xì)胞，使其密度為1×107個(gè)/ml。每管加入100 μl細(xì)胞、5 μl FITC-AnnexinV及5 μl PI。室溫避光孵育15分鐘或4 ℃孵育半小時(shí):標(biāo)記抗體后，加入100 μl 1×binding buffer終止反應(yīng)，1小時(shí)內(nèi)上流式機(jī)檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1.TRIAP1在肝癌及正常組織中的表達(dá)：對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌病人數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，人肝癌組織中TRIAP1的表達(dá)高于癌旁組織。將這些肝癌病人依據(jù)TRIAP1表達(dá)水平分為高低兩組，分析兩組病人的TRIAP1表達(dá)水平對(duì)無疾病生存期(disease free survival，DFS)的影響。結(jié)果顯示,TRIAP1高表達(dá)的肝癌病人的DFS明顯縮短(P=0.003 3)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRIAP1在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，并與肝癌病人預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(圖1)。

A：TCGA數(shù)據(jù)庫分析肝癌組織與癌旁組織TRIAP1表達(dá)差異的箱式圖。B：TCGA數(shù)據(jù)庫分析TRIAP1表達(dá)水平與肝癌病人預(yù)后的K-M生存曲線

2.TRIAP1敲低的肝癌細(xì)胞系并驗(yàn)證：Western blot結(jié)果顯示，Huh7和HepG2轉(zhuǎn)染siRNA實(shí)驗(yàn)組的TRIAP1表達(dá)顯著降低，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染siRNA可有效敲低TRIAP1表達(dá)水平(圖2)。

圖2 Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染TRIAP1 siRNA敲低效率及敲低TRIAP1后p53、p21蛋白水平

3.TRIAP1敲低對(duì)肝癌細(xì)胞中p53和p21表達(dá)的影響：Western blot結(jié)果顯示，敲低TRIAP1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的p53蛋白水平未發(fā)現(xiàn)明顯差異，而p21蛋白的表達(dá)水平在敲低TRIAP1后反而顯著增高(圖2)。說明在肝癌細(xì)胞中TRIAP1可能不通過p53而是直接調(diào)控它的下游p21表達(dá)發(fā)揮作用。為了證實(shí)TRIAP1對(duì)p21的調(diào)控作用，本研究通過RealTime-PCR在RNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證(表1)，TRIAP1敲低后p21的表達(dá)水平升高，明確了TRIAP1對(duì) p21表達(dá)的調(diào)控作用，且與p21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究還采用Capase3/7細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測敲低TRIAP1后凋亡水平，結(jié)果顯示，HepG2和Huh7細(xì)胞在敲低TRIAP1后Capase3/7的蛋白活性比對(duì)照組明顯增強(qiáng)(表2)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了TRIAP1可通過調(diào)控p21表達(dá)進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞凋亡。

表1 敲低TRIAP1后p21 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

4.敲低TRIAP1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響見圖3。敲低TRIAP1實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力下降，且呈時(shí)間依賴性，在第4天時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明TRIAP1有抑制肝癌細(xì)胞增殖能力的作用。

圖3 敲低TRIAP1后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

5.敲低TRIAP1對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響見圖4。結(jié)果表明，敲低TRIAP1實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞的凋亡細(xì)胞顯著增多(P<0.01)。以上結(jié)果表明，TRIAP1可作用于肝癌細(xì)胞凋亡過程，抑制TRIAP1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。

圖4 敲低TRIAP1對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響(A：HepG2；B：Huh7)

討論

本研究通過在人肝癌細(xì)胞株Huh7和HepG2中敲低TRIAPI表達(dá)，并評(píng)估其對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的影響，探討了TRIAPI對(duì)肝癌生物學(xué)行為的重要性。本研究首先使用TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了TRIAP1在腫瘤組織中高表達(dá)且與不良的預(yù)后密切相關(guān)。我們通過CCK8、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)揭示了敲低TRIAP1削弱了肝癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡過程。與TRIAP1在鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用一致[10]，本研究同樣揭示了TRIAP1可促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展。因此，TRIAP1可成為預(yù)測肝癌病人不良預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。隨著小分子抑制劑研究迅猛發(fā)展，TRIAP1也有望成為提高肝癌病人生存率和改善預(yù)后的新靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子p53是重要的抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白，該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控參與細(xì)胞功能和癌變的關(guān)鍵基因，如凋亡、衰老和DNA修復(fù)，大約50%的人類癌癥的發(fā)生都存在p53基因突變[11]。腫瘤中突變型p53可以導(dǎo)致突變型p53蛋白的表達(dá)，這些突變型p53蛋白不僅缺失了野生型p53蛋白的腫瘤抑制活性，反而有助于腫瘤惡性進(jìn)展[12]。p21作為p53生長抑制通路的重要組成部分，直接受到p53的調(diào)控，具有調(diào)節(jié)如細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞生長、DNA損傷和細(xì)胞干性等多種細(xì)胞功能的作用[13]。也有研究表明，p21的表達(dá)可以不依賴于p53誘導(dǎo)。因?yàn)闊o論p53處于野生型或突變型， p21均可被誘導(dǎo)表達(dá)[14]。本研究結(jié)果表明，敲低TRIAP1后上調(diào)了p21的表達(dá)，而敲低TRIAP1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的p53表達(dá)并無差異。因此，在肝癌細(xì)胞中TRIAP1表達(dá)可能與p53表達(dá)無關(guān)，或者通過其他通路導(dǎo)致p53表達(dá)變化不明顯；而TRIAP1在肝癌中可直接地調(diào)控p21的表達(dá)，進(jìn)而延滯細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。本研究證明了TRIAP1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，明確TRIAP1通路在腫瘤中的作用機(jī)制。