楊剛 王冠 熊永福 李蕓 雷蓉 柳彌

肝癌是全球癌癥死因的第二大原因,占原發(fā)性肝癌的70%～90%[1-2]。深入研究肝細胞癌發(fā)生發(fā)展機制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點對改善肝癌病人預(yù)后至關(guān)重要[3-4]。 TP53調(diào)控細胞凋亡抑制因子1(TRIAP1)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有抑制凋亡作用的9k-Da的蛋白質(zhì)[5-6]。據(jù)文獻報道，TRIAP1可以與進化和淋巴相關(guān)的蛋白(PRELI)形成復(fù)合體，通過調(diào)控心磷脂抑制凋亡[7]。 有研究顯示，TRIAP1可通過與熱休克蛋白70(HSP70)相互作用，阻止凋亡蛋白酶激活因子1(APAF1)、細胞色素C和Caspase 9形成凋亡復(fù)合物,調(diào)節(jié)凋亡通路[8]。TRIAP1也在多個研究中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，腫瘤組織中TRIAP1表達較癌旁組織明顯上調(diào)，且與病人生存預(yù)后呈負相關(guān)[5,9]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫驗證腫瘤組織與正常組織中TRIAP1表達差異，利用siRNA沉默方法探究TRIAP1對肝癌細胞的影響及作用機制。

材料與方法

一、材料

Huh7、HepG2人肝癌細胞系、siTRIAP1小干擾RNA等。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：人肝癌細胞株Huh7和HepG2分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合物的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天觀察細胞狀態(tài)，根據(jù)生長情況每2～3天進行細胞換液或消化傳代處理。

2.細胞總RNA的提取以及TRIAP1 mRNA相對水平的測定：RNA的提取和TRIAP1相對水平的測定參考試劑商提供的產(chǎn)品說明書。

3.細胞分組與轉(zhuǎn)染構(gòu)建敲低TRIAP1細胞系：使用上海吉凱生物科技有限公司提供的siTRIAP1小干擾RNA及對照，分別對人肝癌細胞株Huh7和HepG2兩種細胞進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)上述供應(yīng)商提供的說明書轉(zhuǎn)染Huh7和HepG2細胞系。具體操作如下：細胞生長至50%時，使用Opti-MEM培養(yǎng)基對細胞進行饑餓處理2小時，將轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、小干擾RNA分別與Opti-MEM混合均勻，轉(zhuǎn)染體系為2 ml/孔，分別取125 μl Opti-MEM培養(yǎng)基與5 μl Lipo2000和5 μl siRNA混合，靜置5分鐘后將兩種體系混合均勻，靜置20分鐘，加入培養(yǎng)皿，4～6小時后更換完全培養(yǎng)基。48～72小時收獲細胞提取蛋白，用于Western blot印跡實驗檢測轉(zhuǎn)染效率。

4.CCK8細胞檢測：利用胰酶將處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后細胞消化至無菌離心管，離心后加以RPMI1640培養(yǎng)基重新吹打均勻，進行細胞計數(shù)后，以 2×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱，按照時間梯度，分別在0小時、24小時、48小時、72小時、96小時時每孔加入10 μl CCK8試劑，繼續(xù)孵育1小時后，酶標(biāo)儀450 nm檢測其每孔OD值，以上實驗過程重復(fù)3次，使用GraphPad 7.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計繪圖。

5.Western blot印跡檢測 ：提取貼壁細胞蛋白后，參考之前的研究進行Western blot實驗[8]。

6.Annex inV/PI法檢測細胞凋亡：細胞鋪板(以六孔板為例):收取細胞進行鋪板，每孔接種5×109個細胞，待細胞貼壁后，使用PKA激活劑FI,抑制劑H89,KT5720處理細胞，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24小時。胰酶消化細胞，計數(shù)細胞5×105/ml～1×106/ml。使用預(yù)冷的PBS清洗細胞，1 000 prm,4 ℃離心5分鐘,3次。加入凋亡binding buffer重懸細胞，使其密度為1×107個/ml。每管加入100 μl細胞、5 μl FITC-AnnexinV及5 μl PI。室溫避光孵育15分鐘或4 ℃孵育半小時:標(biāo)記抗體后，加入100 μl 1×binding buffer終止反應(yīng)，1小時內(nèi)上流式機檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

1.TRIAP1在肝癌及正常組織中的表達：對TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌病人數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果顯示，人肝癌組織中TRIAP1的表達高于癌旁組織。將這些肝癌病人依據(jù)TRIAP1表達水平分為高低兩組，分析兩組病人的TRIAP1表達水平對無疾病生存期(disease free survival，DFS)的影響。結(jié)果顯示,TRIAP1高表達的肝癌病人的DFS明顯縮短(P=0.003 3)。以上實驗結(jié)果表明，TRIAP1在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，并與肝癌病人預(yù)后呈負相關(guān)(圖1)。

A：TCGA數(shù)據(jù)庫分析肝癌組織與癌旁組織TRIAP1表達差異的箱式圖。B：TCGA數(shù)據(jù)庫分析TRIAP1表達水平與肝癌病人預(yù)后的K-M生存曲線

2.TRIAP1敲低的肝癌細胞系并驗證：Western blot結(jié)果顯示，Huh7和HepG2轉(zhuǎn)染siRNA實驗組的TRIAP1表達顯著降低，驗證了轉(zhuǎn)染siRNA可有效敲低TRIAP1表達水平(圖2)。

圖2 Western blot驗證轉(zhuǎn)染TRIAP1 siRNA敲低效率及敲低TRIAP1后p53、p21蛋白水平

3.TRIAP1敲低對肝癌細胞中p53和p21表達的影響：Western blot結(jié)果顯示，敲低TRIAP1實驗組與對照組的p53蛋白水平未發(fā)現(xiàn)明顯差異，而p21蛋白的表達水平在敲低TRIAP1后反而顯著增高(圖2)。說明在肝癌細胞中TRIAP1可能不通過p53而是直接調(diào)控它的下游p21表達發(fā)揮作用。為了證實TRIAP1對p21的調(diào)控作用，本研究通過RealTime-PCR在RNA水平上進行驗證(表1)，TRIAP1敲低后p21的表達水平升高，明確了TRIAP1對 p21表達的調(diào)控作用，且與p21表達呈負相關(guān)。本研究還采用Capase3/7細胞凋亡檢測試劑盒檢測敲低TRIAP1后凋亡水平，結(jié)果顯示，HepG2和Huh7細胞在敲低TRIAP1后Capase3/7的蛋白活性比對照組明顯增強(表2)。以上結(jié)果進一步證實了TRIAP1可通過調(diào)控p21表達進而影響肝癌細胞凋亡。

表1 敲低TRIAP1后p21 mRNA的相對表達水平

4.敲低TRIAP1對肝癌細胞增殖的影響見圖3。敲低TRIAP1實驗組比對照組細胞的增殖能力下降，且呈時間依賴性，在第4天時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明TRIAP1有抑制肝癌細胞增殖能力的作用。

圖3 敲低TRIAP1后對肝癌細胞增殖的影響

5.敲低TRIAP1對肝癌細胞凋亡的影響見圖4。結(jié)果表明，敲低TRIAP1實驗組比對照組細胞的凋亡細胞顯著增多(P<0.01)。以上結(jié)果表明，TRIAP1可作用于肝癌細胞凋亡過程，抑制TRIAP1可以促進肝癌細胞的凋亡。

圖4 敲低TRIAP1對肝癌細胞凋亡的影響(A：HepG2；B：Huh7)

討論

本研究通過在人肝癌細胞株Huh7和HepG2中敲低TRIAPI表達，并評估其對細胞凋亡和增殖的影響，探討了TRIAPI對肝癌生物學(xué)行為的重要性。本研究首先使用TCGA數(shù)據(jù)庫驗證了TRIAP1在腫瘤組織中高表達且與不良的預(yù)后密切相關(guān)。我們通過CCK8、流式細胞術(shù)等技術(shù)揭示了敲低TRIAP1削弱了肝癌細胞的增殖能力，促進了肝癌細胞的凋亡過程。與TRIAP1在鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用一致[10]，本研究同樣揭示了TRIAP1可促進肝癌發(fā)生發(fā)展。因此，TRIAP1可成為預(yù)測肝癌病人不良預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。隨著小分子抑制劑研究迅猛發(fā)展，TRIAP1也有望成為提高肝癌病人生存率和改善預(yù)后的新靶點。

轉(zhuǎn)錄因子p53是重要的抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白，該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控參與細胞功能和癌變的關(guān)鍵基因，如凋亡、衰老和DNA修復(fù)，大約50%的人類癌癥的發(fā)生都存在p53基因突變[11]。腫瘤中突變型p53可以導(dǎo)致突變型p53蛋白的表達，這些突變型p53蛋白不僅缺失了野生型p53蛋白的腫瘤抑制活性，反而有助于腫瘤惡性進展[12]。p21作為p53生長抑制通路的重要組成部分，直接受到p53的調(diào)控，具有調(diào)節(jié)如細胞周期進展、細胞生長、DNA損傷和細胞干性等多種細胞功能的作用[13]。也有研究表明，p21的表達可以不依賴于p53誘導(dǎo)。因為無論p53處于野生型或突變型， p21均可被誘導(dǎo)表達[14]。本研究結(jié)果表明，敲低TRIAP1后上調(diào)了p21的表達，而敲低TRIAP1實驗組和對照組的p53表達并無差異。因此，在肝癌細胞中TRIAP1表達可能與p53表達無關(guān)，或者通過其他通路導(dǎo)致p53表達變化不明顯；而TRIAP1在肝癌中可直接地調(diào)控p21的表達，進而延滯細胞周期，促進腫瘤細胞增殖。本研究證明了TRIAP1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，明確TRIAP1通路在腫瘤中的作用機制。