亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        肝癌調(diào)控細(xì)胞凋亡抑制因子1的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

        2022-06-14 05:53:46楊剛王冠熊永福李蕓雷蓉柳彌
        臨床外科雜志 2022年5期
        關(guān)鍵詞:肝癌調(diào)控病人

        楊剛 王冠 熊永福 李蕓 雷蓉 柳彌

        肝癌是全球癌癥死因的第二大原因,占原發(fā)性肝癌的70%~90%[1-2]。深入研究肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)對(duì)改善肝癌病人預(yù)后至關(guān)重要[3-4]。 TP53調(diào)控細(xì)胞凋亡抑制因子1(TRIAP1)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有抑制凋亡作用的9k-Da的蛋白質(zhì)[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,TRIAP1可以與進(jìn)化和淋巴相關(guān)的蛋白(PRELI)形成復(fù)合體,通過調(diào)控心磷脂抑制凋亡[7]。 有研究顯示,TRIAP1可通過與熱休克蛋白70(HSP70)相互作用,阻止凋亡蛋白酶激活因子1(APAF1)、細(xì)胞色素C和Caspase 9形成凋亡復(fù)合物,調(diào)節(jié)凋亡通路[8]。TRIAP1也在多個(gè)研究中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān),腫瘤組織中TRIAP1表達(dá)較癌旁組織明顯上調(diào),且與病人生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[5,9]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證腫瘤組織與正常組織中TRIAP1表達(dá)差異,利用siRNA沉默方法探究TRIAP1對(duì)肝癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制。

        材料與方法

        一、材料

        Huh7、HepG2人肝癌細(xì)胞系、siTRIAP1小干擾RNA等。

        二、方法

        1.細(xì)胞培養(yǎng):人肝癌細(xì)胞株Huh7和HepG2分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合物的RPMI1640培養(yǎng)基,于37 ℃,5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞狀態(tài),根據(jù)生長情況每2~3天進(jìn)行細(xì)胞換液或消化傳代處理。

        2.細(xì)胞總RNA的提取以及TRIAP1 mRNA相對(duì)水平的測定:RNA的提取和TRIAP1相對(duì)水平的測定參考試劑商提供的產(chǎn)品說明書。

        3.細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染構(gòu)建敲低TRIAP1細(xì)胞系:使用上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司提供的siTRIAP1小干擾RNA及對(duì)照,分別對(duì)人肝癌細(xì)胞株Huh7和HepG2兩種細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,根據(jù)上述供應(yīng)商提供的說明書轉(zhuǎn)染Huh7和HepG2細(xì)胞系。具體操作如下:細(xì)胞生長至50%時(shí),使用Opti-MEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理2小時(shí),將轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、小干擾RNA分別與Opti-MEM混合均勻,轉(zhuǎn)染體系為2 ml/孔,分別取125 μl Opti-MEM培養(yǎng)基與5 μl Lipo2000和5 μl siRNA混合,靜置5分鐘后將兩種體系混合均勻,靜置20分鐘,加入培養(yǎng)皿,4~6小時(shí)后更換完全培養(yǎng)基。48~72小時(shí)收獲細(xì)胞提取蛋白,用于Western blot印跡實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染效率。

        4.CCK8細(xì)胞檢測:利用胰酶將處于對(duì)數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞消化至無菌離心管,離心后加以RPMI1640培養(yǎng)基重新吹打均勻,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后,以 2×103/孔接種于96孔板,培養(yǎng)于37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,按照時(shí)間梯度,分別在0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)時(shí)每孔加入10 μl CCK8試劑,繼續(xù)孵育1小時(shí)后,酶標(biāo)儀450 nm檢測其每孔OD值,以上實(shí)驗(yàn)過程重復(fù)3次,使用GraphPad 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖。

        5.Western blot印跡檢測 :提取貼壁細(xì)胞蛋白后,參考之前的研究進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)[8]。

        6.Annex inV/PI法檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞鋪板(以六孔板為例):收取細(xì)胞進(jìn)行鋪板,每孔接種5×109個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后,使用PKA激活劑FI,抑制劑H89,KT5720處理細(xì)胞,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24小時(shí)。胰酶消化細(xì)胞,計(jì)數(shù)細(xì)胞5×105/ml~1×106/ml。使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞,1 000 prm,4 ℃離心5分鐘,3次。加入凋亡binding buffer重懸細(xì)胞,使其密度為1×107個(gè)/ml。每管加入100 μl細(xì)胞、5 μl FITC-AnnexinV及5 μl PI。室溫避光孵育15分鐘或4 ℃孵育半小時(shí):標(biāo)記抗體后,加入100 μl 1×binding buffer終止反應(yīng),1小時(shí)內(nèi)上流式機(jī)檢測。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        結(jié)果

        1.TRIAP1在肝癌及正常組織中的表達(dá):對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌病人數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,人肝癌組織中TRIAP1的表達(dá)高于癌旁組織。將這些肝癌病人依據(jù)TRIAP1表達(dá)水平分為高低兩組,分析兩組病人的TRIAP1表達(dá)水平對(duì)無疾病生存期(disease free survival,DFS)的影響。結(jié)果顯示,TRIAP1高表達(dá)的肝癌病人的DFS明顯縮短(P=0.003 3)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TRIAP1在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用,并與肝癌病人預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(圖1)。

        A:TCGA數(shù)據(jù)庫分析肝癌組織與癌旁組織TRIAP1表達(dá)差異的箱式圖。B:TCGA數(shù)據(jù)庫分析TRIAP1表達(dá)水平與肝癌病人預(yù)后的K-M生存曲線

        2.TRIAP1敲低的肝癌細(xì)胞系并驗(yàn)證:Western blot結(jié)果顯示,Huh7和HepG2轉(zhuǎn)染siRNA實(shí)驗(yàn)組的TRIAP1表達(dá)顯著降低,驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染siRNA可有效敲低TRIAP1表達(dá)水平(圖2)。

        圖2 Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染TRIAP1 siRNA敲低效率及敲低TRIAP1后p53、p21蛋白水平

        3.TRIAP1敲低對(duì)肝癌細(xì)胞中p53和p21表達(dá)的影響:Western blot結(jié)果顯示,敲低TRIAP1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的p53蛋白水平未發(fā)現(xiàn)明顯差異,而p21蛋白的表達(dá)水平在敲低TRIAP1后反而顯著增高(圖2)。說明在肝癌細(xì)胞中TRIAP1可能不通過p53而是直接調(diào)控它的下游p21表達(dá)發(fā)揮作用。為了證實(shí)TRIAP1對(duì)p21的調(diào)控作用,本研究通過RealTime-PCR在RNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證(表1),TRIAP1敲低后p21的表達(dá)水平升高,明確了TRIAP1對(duì) p21表達(dá)的調(diào)控作用,且與p21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究還采用Capase3/7細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測敲低TRIAP1后凋亡水平,結(jié)果顯示,HepG2和Huh7細(xì)胞在敲低TRIAP1后Capase3/7的蛋白活性比對(duì)照組明顯增強(qiáng)(表2)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了TRIAP1可通過調(diào)控p21表達(dá)進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞凋亡。

        表1 敲低TRIAP1后p21 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

        4.敲低TRIAP1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響見圖3。敲低TRIAP1實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力下降,且呈時(shí)間依賴性,在第4天時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明TRIAP1有抑制肝癌細(xì)胞增殖能力的作用。

        圖3 敲低TRIAP1后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

        5.敲低TRIAP1對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響見圖4。結(jié)果表明,敲低TRIAP1實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)胞的凋亡細(xì)胞顯著增多(P<0.01)。以上結(jié)果表明,TRIAP1可作用于肝癌細(xì)胞凋亡過程,抑制TRIAP1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。

        圖4 敲低TRIAP1對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響(A:HepG2;B:Huh7)

        討論

        本研究通過在人肝癌細(xì)胞株Huh7和HepG2中敲低TRIAPI表達(dá),并評(píng)估其對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的影響,探討了TRIAPI對(duì)肝癌生物學(xué)行為的重要性。本研究首先使用TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了TRIAP1在腫瘤組織中高表達(dá)且與不良的預(yù)后密切相關(guān)。我們通過CCK8、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)揭示了敲低TRIAP1削弱了肝癌細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡過程。與TRIAP1在鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用一致[10],本研究同樣揭示了TRIAP1可促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展。因此,TRIAP1可成為預(yù)測肝癌病人不良預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。隨著小分子抑制劑研究迅猛發(fā)展,TRIAP1也有望成為提高肝癌病人生存率和改善預(yù)后的新靶點(diǎn)。

        轉(zhuǎn)錄因子p53是重要的抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白,該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控參與細(xì)胞功能和癌變的關(guān)鍵基因,如凋亡、衰老和DNA修復(fù),大約50%的人類癌癥的發(fā)生都存在p53基因突變[11]。腫瘤中突變型p53可以導(dǎo)致突變型p53蛋白的表達(dá),這些突變型p53蛋白不僅缺失了野生型p53蛋白的腫瘤抑制活性,反而有助于腫瘤惡性進(jìn)展[12]。p21作為p53生長抑制通路的重要組成部分,直接受到p53的調(diào)控,具有調(diào)節(jié)如細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞生長、DNA損傷和細(xì)胞干性等多種細(xì)胞功能的作用[13]。也有研究表明,p21的表達(dá)可以不依賴于p53誘導(dǎo)。因?yàn)闊o論p53處于野生型或突變型, p21均可被誘導(dǎo)表達(dá)[14]。本研究結(jié)果表明,敲低TRIAP1后上調(diào)了p21的表達(dá),而敲低TRIAP1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的p53表達(dá)并無差異。因此,在肝癌細(xì)胞中TRIAP1表達(dá)可能與p53表達(dá)無關(guān),或者通過其他通路導(dǎo)致p53表達(dá)變化不明顯;而TRIAP1在肝癌中可直接地調(diào)控p21的表達(dá),進(jìn)而延滯細(xì)胞周期,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。本研究證明了TRIAP1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,明確TRIAP1通路在腫瘤中的作用機(jī)制。

        猜你喜歡
        肝癌調(diào)控病人
        誰是病人
        如何調(diào)控困意
        經(jīng)濟(jì)穩(wěn)中有進(jìn) 調(diào)控托而不舉
        中國外匯(2019年15期)2019-10-14 01:00:34
        LCMT1在肝癌中的表達(dá)和預(yù)后的意義
        順勢(shì)而導(dǎo) 靈活調(diào)控
        病人膏育
        故事大王(2016年4期)2016-05-14 18:00:08
        microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展及診治中的作用
        SUMO修飾在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用
        Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
        microRNA在肝癌診斷、治療和預(yù)后中的作用研究進(jìn)展
        东风日产车是不是国产的| 五月天综合在线| 亚州AV成人无码久久精品| 久久精品国产亚洲av沈先生| 国产精品久久久天天影视| 精品国产乱码久久久久久影片| 狠狠狠色丁香婷婷综合激情| 亚洲av色香蕉一区二区三区蜜桃| 国产高潮流白浆视频在线观看| 中文无码一区二区三区在线观看| 中文字幕无码精品亚洲资源网久久| 欧洲国产成人精品91铁牛tv| 日本特殊按摩在线观看| 国产精品美女久久久网站三级| 国产av麻豆mag剧集| 在线视频这里只有精品| av成人资源在线播放| 凌辱人妻中文字幕一区| 亚洲av成人无码网站大全| 999精品免费视频观看| 久久精品国产亚洲不卡| 少妇性l交大片7724com| 亚洲一区精品无码色成人| 国内精品视频成人一区二区 | 中文字幕精品久久天堂一区| 人妻丰满精品一区二区| 国产大片内射1区2区| 久久精品国产自清天天线| 无码流畅无码福利午夜| 国产av在线观看一区二区三区| 国内精品视频在线播放不卡 | 免费av一区男人的天堂| 精品九九人人做人人爱| 欧美va亚洲va在线观看| 亚洲视频在线观看青青草| 精品一区二区三区芒果| 国产精品麻豆成人av电影艾秋| 久久精品成人91一区二区| 一本大道久久a久久综合精品| 色诱视频在线观看| 色老头一区二区三区|