葉彬 向秋 金文杰

肺癌分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，NSCLC占肺惡性腫瘤的80%左右[1-2]。NSCLC預(yù)后依然較差[3]。叉頭框蛋白Q1(forkhead box Q1，F(xiàn)OXQ1)是一個(gè)具有高度保守的叉頭框(FOX)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用[4]。細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinDl)是腫瘤細(xì)胞增殖周期G1、S期限制點(diǎn)的調(diào)控因子，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。本研究探討FOXQ1和CyclinDl兩種因子在NSCLC組織中的表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)、預(yù)后的相關(guān)性，以及二者是否存在相關(guān)性、二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC預(yù)后分析的意義。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2014年12月～2017年10月我院胸心外科確診并接受根治性手術(shù)的NSCLC病人196例，選取NSCLC組織作為觀察組，同時(shí)選取癌旁組織(距腫瘤邊緣>5cm)作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2018年版)中肺癌手術(shù)適應(yīng)證和禁忌證，且經(jīng)術(shù)后病理診斷為NSCLC；(2)均行肺癌根治性切除術(shù)；(3)有完整詳細(xì)的臨床隨訪資料和病理診斷資料；(4)術(shù)前未接受免疫治療、放化療或靶向治療；(5)死亡原因均為肺癌；(6)病人或家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受新輔助治療；合并有其他原發(fā)性腫瘤；行姑息性手術(shù)；隨訪資料缺失。196例病人中男147例，女49例；年齡33～76歲，平均年齡(54.97±9.76)歲；中高分化125例，低分化71例；鱗癌72例，腺癌90例，其他類型34例；已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移112例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84例；Ⅰ期50例，Ⅱ期75例，Ⅲ期63例，Ⅳ期8例。

二、方法

1.檢測(cè)方法：采用EnVisio法檢測(cè)組織中FOXQ1和CyclinDl蛋白的表達(dá)。石蠟切片，經(jīng)抗原修復(fù)、清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉后，滴加FOXQ1、CyclinDl抗體進(jìn)行一抗孵育，后加入生物素標(biāo)記進(jìn)行二抗孵育，通過(guò)DAB顯色及復(fù)染后完成免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果判斷：兩種蛋白陽(yáng)性顯色為淺黃色至棕黃色顆粒。根據(jù)染色強(qiáng)度與染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡(×400)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)≥1000個(gè)細(xì)胞。染色細(xì)胞百分率評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞率≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。表達(dá)結(jié)果為2項(xiàng)乘積，0～3分為低或無(wú)表達(dá)，4～12分為高表達(dá)。

2.隨訪：采用來(lái)院就診或電話隨訪。隨訪截至2020年8月31日，隨訪時(shí)間1～60個(gè)月。隨訪內(nèi)容為病人無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)和總體生存時(shí)間(overall survival, OS)。PFS為手術(shù)開(kāi)始至第1次腫瘤出現(xiàn)繼發(fā)性生長(zhǎng)的時(shí)間；OS為手術(shù)開(kāi)始至末次隨訪或死亡的時(shí)間。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)分析FOXQ1與CyclinD1在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和和多因素分析，生存率分析采用Kaplan-Meier法，比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.FOXQ1、CyclinDl蛋白在NSCLC和癌旁組織中表達(dá)比較見(jiàn)表1和圖1。NSCLC組織中FOXQ1、CyclinDl蛋白高表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 FOXQ1、CyclinDl蛋白在NSCLC和癌旁組織中表達(dá)(例，%)

A:FOXQ1蛋白在NSCLC組織中高表達(dá)；B:FOXQ1蛋白在NSCLC組織中低表達(dá);C:CyclinDl蛋白在NSCLC組織中高表達(dá)；D:CyclinDl蛋白在NSCLC組織中低表達(dá)

2.NSCLC病人FOXQ1、CyclinDl蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系：NSCLC組織中FOXQ1、CyclinDl高表達(dá)與年齡、性別、吸煙、病理類型、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，與病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 FOXQ1、CyclinDl蛋白表達(dá)與NSCLC病人臨床病理特征的關(guān)系

3.NSCLC組織中FOXQ1和CyclinDl蛋白的相關(guān)性分析：在NSCLC組織中，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl蛋白均為高表達(dá)的有89例，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl蛋白均為無(wú)或低表達(dá)的有30例，F(xiàn)OXQ1高表達(dá)和CyclinDl蛋白無(wú)或低表達(dá)的有41例 ，F(xiàn)OXQ1無(wú)或低表達(dá)和CyclinDl高表達(dá)的有36例。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示，在NSCLC組織中，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl蛋白的表達(dá)情況呈正相關(guān)(r=-0.639,P<0.001)。

4.預(yù)后影響因素分析：采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)影響NSCLC根治術(shù)病人PFS和OS的因素進(jìn)行分析。影響NSCLC根治術(shù)病人PFS的單因素分析顯示，病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXQ1高表達(dá)、CyclinDl高表達(dá)、FOXQ1高表達(dá)+CyclinDl高表達(dá)均與病人PFS有關(guān)(P<0.05)；為了排除各因素之間的相互影響,將單因素分析中有意義的變量納入多因素分析顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXQ1高表達(dá)、CyclinDl高表達(dá)、FOXQ1高表達(dá)+CyclinDl高表達(dá)均是影響病人PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。影響NSCLC根治術(shù)病人OS的單因素分析顯示,病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXQ1高表達(dá)、CyclinDl高表達(dá)、FOXQ1高表達(dá)+CyclinDl高表達(dá)均與病人OS有關(guān)(P<0.05)；為了排除各因素之間的相互影響,將單因素分析中有意義的變量納入多因素分析顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXQ1高表達(dá)、CyclinDl高表達(dá)、FOXQ1高表達(dá)+CyclinDl高表達(dá)均影響病人OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 PFS的單因素和多因素分析

表4 OS的單因素和多因素分析

5.生存分析：196例非小細(xì)胞肺癌病人中，死亡94例，生存102例。Kaplan-Meier分析顯示，F(xiàn)OXQ1高表達(dá)病人PFS、OS短于低或無(wú)表達(dá)組(χ2=6.328、6.107,P=0.012)；CyclinDl高表達(dá)病人PFS、OS短于低或無(wú)表達(dá)組(χ2=4.983、5.550,P=0.026)； FOXQ1、CyclinDl兩者高表達(dá)病人PFS、OS短于其他病人(χ2=145.248、122.599,P=0.006)；FOXQ1、CyclinDl兩者高表達(dá)病人PFS、OS短于FOXQ1、CyclinDl單獨(dú)高表達(dá)病人(χ2=35.269、36.104,P=0.006)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 兩者高表達(dá)病人和FOXQ1、CyclinDl單獨(dú)高表達(dá)病人的PFS生存曲線

圖3 兩者高表達(dá)病人和FOXQ1、CyclinDl單獨(dú)高表達(dá)病人的OS生存曲線

討論

FOXQ1是轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在多種組織中廣泛表達(dá)，可通過(guò)識(shí)別并結(jié)合相關(guān)下游靶基因的近端或遠(yuǎn)端順式作用元件，實(shí)現(xiàn)對(duì)眾多下游靶基因表達(dá)水平的正向或負(fù)向調(diào)控[6-8]。Fan等[9]研究報(bào)道，F(xiàn)OXQ1是惡性腫瘤中wnt信號(hào)通路的新的激活標(biāo)志物。基因共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌[10]、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌及胰腺癌等多種惡性腫瘤中，癌細(xì)胞中FOXQ1高表達(dá)與wnt信號(hào)通路活化相關(guān)[11-14]。FOXQ1在NSCLC中發(fā)揮重要作用，其可通過(guò)結(jié)合上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化重要調(diào)控分子上皮型E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的基因啟動(dòng)子區(qū)E-box來(lái)轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制E-cadherin的表達(dá)，從而降低細(xì)胞間的黏附力，促進(jìn)細(xì)胞游離及延伸生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，進(jìn)而發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[15]。大量研究表明，在胃癌、肝癌、乳腺癌及結(jié)腸癌組織中FOXQ1蛋白高表達(dá)，預(yù)示著病人預(yù)后不良[13,10-11]。

惡性腫瘤是一種細(xì)胞周期疾病，在遺傳突變和環(huán)境改變的影響下，基因突變及染色體異常分離導(dǎo)致細(xì)胞周期異常調(diào)控以至于細(xì)胞惡性增殖形成腫瘤[16]。Cyclins是一個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的核蛋白家族，是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的核心分子,其在細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[17-18]。Cyclin D1主要通過(guò)激活G1期特有的周期蛋白依賴依賴性激酶CDK4并結(jié)合，然后使G1期周期抑制蛋白磷酸化，被磷酸化的周期抑制蛋白會(huì)與與其結(jié)合的E2F轉(zhuǎn)錄因子分離，進(jìn)而就會(huì)推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入到S期[19]。有研究表明，Cyclin D1在腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，Cyclin D1是細(xì)胞周期G1期中衡量表達(dá)的癌基因，其過(guò)量表達(dá)可引發(fā)G1期時(shí)間減少、加速細(xì)胞分裂，誘發(fā)細(xì)胞增殖失控而惡化，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。有研究表明，Cyclin D1蛋白在鼻咽癌、乳腺癌和胃癌等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，在NSCLC細(xì)胞中，抑制Cyclin D1的表達(dá)后能夠使細(xì)胞的增殖發(fā)生阻礙[21-23]。本研究結(jié)果表明，NSCLC組織中CyclinDl蛋白高表達(dá)率高于癌旁組織；NSCLC組織中CyclinDl高表達(dá)與病理分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；Cox回歸分析顯示，CyclinDl是影響NSCLC病人PFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；Kaplan-Meier分析顯示，CyclinDl高表達(dá)組病人PFS和OS低于低或無(wú)表達(dá)組。結(jié)果表明,CyclinD 1高表達(dá)與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。

Spearman相關(guān)性分析顯示，在NSCLC組織中，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl蛋白的表達(dá)情況呈正相關(guān)；Cox回歸分析顯示，F(xiàn)OXQ1和CyclinDl兩者均高表達(dá)是影響NSCLC病人PFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；Kaplan-Meier分析顯示，F(xiàn)OXQ1、CyclinDl兩者高表達(dá)病人PFS和OS低于其他病人；FOXQ1、CyclinDl兩者高表達(dá)病人PFS和OS低于FOXQ1、CyclinDl單獨(dú)一種高表達(dá)病人。結(jié)果表明,FOXQ1可能通過(guò)調(diào)控CyclinDl，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起作用。兩者聯(lián)合檢測(cè)可應(yīng)用于臨床判斷NSCLC的轉(zhuǎn)移潛能及病人的預(yù)后。