甘國渝，陳佛文，鄒家龍，何 潔，陳 偉，高旭園，李繼福*

（1.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心/長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.荊州市荊州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖北 荊州 434025）

江漢平原是湖北省冬油菜的主產(chǎn)區(qū)，常年種植規(guī)模約67萬hm2，占全省播種面積的60%以上［1］。冬油菜作為南方越冬作物，基本不與主糧爭地，且有養(yǎng)地功能，這是因?yàn)橛筒私斩捄吐淙~還田可補(bǔ)充土壤有機(jī)質(zhì)、提高土壤肥力和改善土壤生物學(xué)特性，如微生物組成及其多樣性［2］。長期冬油菜種植對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生選擇和富集的作用，而微生物又是土壤的重要組成部分，在土壤有機(jī)碳氮礦化和礦質(zhì)元素地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用，是衡量土壤質(zhì)量的重要生物指標(biāo)［3］。施肥作為油菜栽培過程中的重要環(huán)節(jié)，對(duì)產(chǎn)量形成和養(yǎng)分供給產(chǎn)生顯著影響，而施肥或者肥料投入不足會(huì)導(dǎo)致根際微生物的優(yōu)勢種群和相對(duì)含量發(fā)生變化，從而影響有機(jī)物礦化進(jìn)程和養(yǎng)分供給水平［4］。因此，開展長期養(yǎng)分缺乏脅迫下土壤微生物組成和多樣性研究有助于從微生物層面解析冬油菜根際微生態(tài)環(huán)境變化對(duì)土壤生物肥力改變的反饋機(jī)制。土壤微生物作為土壤養(yǎng)分的補(bǔ)充儲(chǔ)備庫，可為冬油菜生長提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。冬油菜根際微生物緊密依附在根際土壤顆粒中，與根系存在適應(yīng)協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系。根際微生物能夠釋放營養(yǎng)物質(zhì)到土壤介質(zhì)中，促進(jìn)作物成長［5］，而植物通過根系分泌物可為微生物繁殖提供碳源。有研究發(fā)現(xiàn)，化肥平衡施用、有機(jī)無機(jī)肥配施均顯著提高土壤中細(xì)菌數(shù)量、多樣性和豐富度，有機(jī)無機(jī)肥配施還改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，特別是降低放線菌門、增加擬桿菌門的相對(duì)豐度，更有利于土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和健康，而肥料投入不足則會(huì)導(dǎo)致土壤肥力下降和生態(tài)環(huán)境失衡［6］。

近20年來，分子生物技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域快速發(fā)展，尤其是二代，甚至三代高通量測序的應(yīng)用，為深入了解根際營養(yǎng)變化對(duì)土壤微生物生命發(fā)育演化和種群組成的影響提供技術(shù)支撐［7-9］。許艷蕊等［10］對(duì)玉米根際微生物群的季節(jié)性變化研究發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)生長階段，根際微生物活性和優(yōu)勢物種相對(duì)豐度明顯高于土壤本體；但在生殖生長階段，根系活力和可溶性分泌物釋放量降低，根際效應(yīng)也隨之消失，導(dǎo)致可培養(yǎng)細(xì)菌的生物多樣性也明顯下降［11-12］。張秫華等［13］利用高通量測序技術(shù)分析了川芎根際與非根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及差異，發(fā)現(xiàn)真菌群落均勻度和多樣性表現(xiàn)為非根際土＞根際土，豐富度表現(xiàn)為根際土＞非根際土。另有研究表明，苜蓿根際和非根際土壤細(xì)菌、真菌數(shù)量均隨播量的增加呈先升高后降低的趨勢，在播量達(dá)到一定值時(shí)，根際和非根際土壤微生物數(shù)量最大，且根際高于非根際［14］。油菜屬于對(duì)養(yǎng)分較為敏感的田間作物，尤其對(duì)氮肥和磷肥，而油菜根際和非根際微生物對(duì)養(yǎng)分脅迫的響應(yīng)是否存在差異還缺乏足夠證據(jù)，需要進(jìn)一步證實(shí)。

當(dāng)前，不同施肥措施對(duì)農(nóng)田細(xì)菌和真菌組成及其多樣性的研究較為廣泛和深入，然而，大量肥料的投入使得土壤積累的養(yǎng)分含量偏高，不僅造成資源的浪費(fèi)，還影響肥料的吸收利用率［15］。因此，對(duì)化肥減施或不施對(duì)土壤生物特性的研究還較為薄弱，尤其是在長期單一肥料缺乏下，根際微生物如何適應(yīng)土壤養(yǎng)分狀況還不明確。綜合上述問題，本文基于田間肥料定位試驗(yàn)來探明冬油菜根際、非根際細(xì)菌和真菌群落組成結(jié)構(gòu)差異及其演化對(duì)氮肥、磷肥和鉀肥缺乏的響應(yīng)，為冬油菜根際生態(tài)過程中的養(yǎng)分調(diào)控、環(huán)境污染防治和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)點(diǎn)位于湖北省荊州市荊州區(qū)川店鎮(zhèn)（30°33′24″ N，112°4′56″ E，海拔52 m），為河流沖積物發(fā)育形成的水稻土。2011年水稻季開始進(jìn)行肥效田間試驗(yàn)，采用一年兩熟的水稻-油菜輪作模式。試驗(yàn)前，耕層（0～20 cm）土壤基本理化性質(zhì)為pH 6.4、全氮0.6 g/kg、堿解氮275.3 mg/kg、有機(jī)質(zhì)28.8 g/kg、有效磷4.44 mg/kg、速效鉀96.6 mg/kg、緩效鉀528.2 mg/kg。本研究共選取其中4個(gè)處理，分別為：（1）施磷鉀肥不施氮肥（-N）、（2）施氮鉀肥不施磷肥（-P）、（3）施氮磷肥不施鉀肥（-K）和（4）施氮磷鉀肥（NPK）。各處理重復(fù)3次，小區(qū)面積20 m2，隨機(jī)區(qū)組排列。各處理除不施用的肥料外，每季肥料用量均按當(dāng)?shù)赝扑]， 即：N 180 kg/hm2、P2O590 kg/hm2和K2O 120 kg/hm2，其中油菜季補(bǔ)施硼肥15 kg/hm2。肥料種類為尿素（N 46%）、過磷酸鈣（P2O512%）、氯化鉀（K2O 60%）和硼砂（B 11%）。具體用量和施用方法為：水稻季氮肥分3次施用，其中基肥占50%、分蘗肥和穗肥各占25%；磷肥和鉀肥在水稻移栽前作基肥一次性施用。冬油菜季氮肥分3次施用，其中基肥占60%，越冬肥和蕾薹肥分別占20%；磷肥、鉀肥和硼肥在油菜移栽前一次性基施。其他田間管理均按當(dāng)?shù)刈顑?yōu)方式進(jìn)行。

1.2 樣品采樣與測定

1.2.1 土壤樣品

基礎(chǔ)土樣于2011年5月冬油菜收獲后采集，取0～20 cm耕層土壤，按照四分法取1 kg帶回實(shí)驗(yàn)室，風(fēng)干磨細(xì)過0.85 mm篩，保存。土壤基本理化性質(zhì)如pH、全氮含量等指標(biāo)按照常規(guī)方法［16］測定。2020年4月，成熟期在各小區(qū)選取長勢均勻的油菜4株連根拔起，抖掉附著的松散土，用刀片采集根際土壤，作混合樣［17］。同時(shí)，用不銹鋼土鉆采集油菜間隙土壤作非根際土，具體標(biāo)注見表1。

表1 樣品名稱標(biāo)注

1.2.2 土壤微生物基因組DNA提取

用強(qiáng)力DNA分離試劑盒（MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，USA）提取土壤DNA。對(duì)樣品進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠檢測DNA的長度和完整性，利用NanoDrop紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，NC2000）檢測DNA的濃度和純度。

1.2.3 DNA擴(kuò)增及測序

細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)擴(kuò)增采用前引物序列338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3’）和后引物序列806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）［18］，真菌ITS擴(kuò)增采用前引物序列ITS1F（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）和后引物序列ITS2（5’- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）［19］。目標(biāo)條帶膠回收純化后進(jìn)行文庫構(gòu)建，利用Illumina-MiSeqPE250平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序原始數(shù)據(jù)去除引物接頭序列和各低質(zhì)量堿基后進(jìn)行拼接，舍棄長度短于160 bp的序列，去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體后，得到每個(gè)樣本的有效序列數(shù)據(jù)。以97%為規(guī)定閾值，對(duì)16S和18S序列劃分可操作分類單元（OTU）。采用QIIME，調(diào)用UCLUST序列對(duì)比工具按97%的序列相似度進(jìn)行歸并，并選取每個(gè)OTU度最高的序列作為該OTU的代表序列。針對(duì)細(xì)菌16S rRNA和真菌18S rRNA分別采用Greengenes數(shù)據(jù)庫和Silva數(shù)據(jù)庫作為OTU分類地位鑒定的模板序列。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016、OriginPro 2019b進(jìn)行計(jì)算和處理，采用LSD法檢驗(yàn)0.05水平上的差異顯著性。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，處理標(biāo)注見表1。利用R的vegan工具包以微生物群落結(jié)構(gòu)作為響應(yīng)變量、土壤養(yǎng)分含量作為解釋變量進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬油菜根際與非根際土壤養(yǎng)分含量

由表2可知，長期養(yǎng)分缺乏導(dǎo)致處理間pH和養(yǎng)分含量有一定的差異。各處理根際養(yǎng)分含量與非根際相比有明顯不同。土壤pH結(jié)果顯示，與非根際相比，各處理根際土壤pH呈下降的趨勢，而有機(jī)質(zhì)、有效磷和速效鉀含量有富集的趨勢，其中-N1、-P1、-K1和NPK1土樣的有機(jī)質(zhì)含量比非根際分別提高6.8%、6.7%、6.6%和6.5%；而緩效鉀根際非根際之間差異并不顯著，這可能與背景值較高有關(guān)。

表2 各處理冬油菜根際與非根際土壤養(yǎng)分含量

2.2 冬油菜根際與非根際微生物多樣性

配對(duì)t檢驗(yàn)表明，除-P處理外，各處理油菜根際、非根際的細(xì)菌群落多樣性（Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)）無顯著性差異（P＞0.05），但從趨勢上來看，-P和-K處理的非根際土壤細(xì)菌群落多樣性比根際高，而-N和NPK處理的根際細(xì)菌多樣性略高于非根際土壤（表3）。與細(xì)菌多樣性不同，-N、-P處理的油菜根際真菌多樣性顯著低于非根際（P＜0.05），而NPK處理的根際與非根際真菌多樣性無明顯差異。同時(shí)，從Chao1和ACE指數(shù)（表3）來看，各處理根際和非根際細(xì)菌、真菌的豐富度表現(xiàn)不一。-N處理的根際細(xì)菌和真菌豐富度高于非根際，而-P、-K和NPK處理的微生物豐富度則與-N處理相反?？傊?，長期養(yǎng)分缺乏對(duì)冬油菜根際和非根際細(xì)菌多樣性影響不明顯，而對(duì)真菌多樣性的影響最為顯著。

表3 土壤細(xì)菌、真菌的豐度和群落結(jié)構(gòu)多樣性

2.3 冬油菜根際與非根際微生物群落組成

2.3.1 細(xì)菌和真菌門水平分類

由圖1A結(jié)果可知，細(xì)菌門分類水平上，各處理非根際優(yōu)勢物種是綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和Rokubacteria，其平均相對(duì)豐度分別為29.8%、29.0%、15.9%和4.4%；而根際優(yōu)勢物種依次是綠彎菌門、酸桿菌門、變形菌門和Patescibacteria，其平均相對(duì)豐度分別為32.0%、22.3%、19.2%和6.4%。具體來看，-P處理根際Patescibacteria的相對(duì)豐度顯著高于非根際。-N處理下，根際綠彎菌門相對(duì)豐度明顯高于非根際。NPK處理根際變形菌門相對(duì)豐度顯著高于非根際，而-K處理的根際與非根際各門細(xì)菌相對(duì)豐度差異不顯著。

圖1B結(jié)果顯示，各處理真菌群落中，子囊菌門（Ascomycota）和Unidentified的相對(duì)豐度最高，表明門水平上未被分類的菌群數(shù)量仍較多，其中子囊菌門在非根際和根際的平均相對(duì)豐度分別為46.4%和57.5%。-N和-K處理下，Rozellomycota在非根際的相對(duì)豐度分別可達(dá)10.4%和8.0%，在根際的相對(duì)豐度分別為10.7%和14.9%。-P和NPK處理下，Rozellomycota門在非根際的平均相對(duì)豐度分別為14.3%和17.5%，在根際的平均相對(duì)豐度則分別降至3.3%和11.7%。

圖1 細(xì)菌和真菌門水平上的相對(duì)豐度

2.3.2 細(xì)菌和真菌屬水平分類

細(xì)菌屬分類水平上（圖2A），各處理菌群相對(duì)豐度均較低，Uncultured、Unidentified和Other在根際和非根際的相對(duì)豐度均較高，表明各處理中不能培養(yǎng)、沒有鑒定或者未被分類的菌群較多。優(yōu)勢屬種在各處理的表現(xiàn)存在一定的差異，-N、-P和-K處理中，Haliangium在非根際土壤的相對(duì)豐度分別為1.4%、1.0%和1.2%，而在根際的相對(duì)豐度則分別降至0.5%、0.6%和1.0%。-N和-P處理下，Solibacter在非根際的相對(duì)豐度分別為1.2%和1.5%，而在根際土壤的相對(duì)豐度分別為1.0%和1.1%。-N和-P處理下，Anaeromyxobacter屬在非根際的相對(duì)豐度分別為1.0%和0.9%，在根際的相對(duì)豐度則分別降至0.3%和0.8%。-K和NPK處理下，Anaeromyxobacter在根際的相對(duì)豐度分別為0.9%和2.4%，在非根際的相對(duì)豐度則降至0.7%和1.0%。此 外，-N和-P處 理 下，Haliangium、Solibacter和Anaeromyxobacter在非根際的相對(duì)豐度均高于根際。

圖2 細(xì)菌和真菌屬水平上的相對(duì)豐度

圖2B結(jié)果顯示，除已知物種外，真菌屬群落中存在較多的稀有物種（Other），它們相對(duì)豐度低，而種類多。-N處理油菜非根際優(yōu)勢類群是Acaulium，相對(duì)豐度可達(dá)56.2%。支頂孢屬（Acremonium）為-P處理油菜非根際優(yōu)勢類群，其相對(duì)豐度為17.8%；而Phialocephala和Akanthomvces為-P處理根際優(yōu)勢類群，其相對(duì)豐度分別為32.6%和23.2%。油壺菌屬（Olpidium）為-K處理根際和NPK處理非根際優(yōu)勢類群，其相對(duì)豐度分別為25.3%和21.0%。

2.4 冬油菜根際與非根際微生物群落結(jié)構(gòu)差異

PCoA主成分分析可將樣品微生物多樣性差異反映在二維坐標(biāo)圖上，主成分軸用來解釋差異。圖3結(jié)果顯示，長期不同養(yǎng)分缺乏對(duì)油菜根際和非根際微生物差異的影響不一。對(duì)細(xì)菌而言，第1主成分（PCoA1）和第2主成分（PCoA2）分別解釋差異的42.0%和33.1%，合計(jì)貢獻(xiàn)率占75.1%，表明養(yǎng)分差異使得各處理細(xì)菌群落發(fā)生較大變異，尤其是-N處理的根際與非根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異最大，其他處理根際和非根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異也較為明顯。對(duì)于真菌而言，第1主成分和第2主成分分別解釋差異的34.6%和26.3%，合計(jì)貢獻(xiàn)率占60.9%，低于細(xì)菌變異解釋率。從圖3B可知，-N處理根際與非根際真菌群落分布差距最大，而-P、-K和NPK處理的根際與非根際真菌群落差距較小，受養(yǎng)分缺乏影響不顯著。

圖3 細(xì)菌和真菌PCoA主坐標(biāo)分析

熱圖可在屬水平上將不同相對(duì)豐度的OTU聚類，并根據(jù)顏色深淺反映不同處理的菌群物種關(guān)系。從圖4A可以看出，施肥處理和根際效應(yīng)顯著影響各樣本中優(yōu)勢細(xì)菌菌群分布和相對(duì)豐度。NPK處理根際土壤中，大部分細(xì)菌群落的相對(duì)豐度較高，而在非根際土中則較低。非根際中的Anaeromyxobacter、Geobacter、Nitrospira、Syntrophorhabdus和Sh765B-TzT-35在-N、-P和NPK處理中的相對(duì)豐度較高，而在-K處理中較低。Sh765B-TzT-35和Acidibacter、Gemmatimonas和Gemmatirosa、Gaiella、Ignavibacterium分別為-N、-K、-P、NPK處理的優(yōu)勢屬種。根際土壤中Ignavibacterium和Pseudolabrys在-N和-K處理的相對(duì)豐度較低，而在-P和NPK處理中則為優(yōu)勢屬；Chthonomonas在-P和NPK處理中相對(duì)豐度較低，而在-N和-K處理中為優(yōu)勢屬。

圖4 各處理優(yōu)勢細(xì)菌和真菌屬熱圖分析

根際真菌Sarocladium、Itersonilia、Sarcos-phaera、Papiliotrema、Mucronella、Saitozyma、Chaetomium和Parmotrema等屬以及非根際真菌Olpidium、Physalospora、Myceliophthora和Phaeosaccardinula在4個(gè)處理間均具有明顯差異（圖4B）。此外，-K處理根際中有6種真菌的相對(duì)豐度明顯高于其他3個(gè)處理，包括Derxomyces、Chaetomium、Termitomyces、Olpidium、Stilbella和Sacculospora。-P處理非根際有6種真菌相對(duì)豐度明顯高于其他3個(gè)處理，包括Schizangiella、Tuber、Cookeina、Acremonium、Camarophyllus和Ochroconis。

2.5 冬油菜土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分冗余分析

冗余分析圖可直觀地反映土壤養(yǎng)分含量對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的解釋程度，影響因素之間的夾角代表各因素之間的相關(guān)性大小，其中銳角表示兩個(gè)因素正相關(guān)，直角表示不相關(guān)，鈍角表示負(fù)相關(guān)；而射線的長短代表環(huán)境因子對(duì)研究對(duì)象的解釋度高低，射線越長，解釋度越高，反之越低。由圖5可知，土壤速效鉀、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷含量及pH是影響土壤細(xì)菌（pseudo-F=5.7，P=0.004）和 真 菌（pseudo-F=4.3，P=0.008）群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵參數(shù)，其中pH、速效鉀和有效磷含量對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著，而有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為明顯。

圖5 微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分冗余分析

3 討論與結(jié)論

3.1 長期養(yǎng)分缺乏對(duì)冬油菜土壤微生物多樣性及養(yǎng)分的影響

Illumina Miseq測序技術(shù)具有通量高、靈敏度高、準(zhǔn)確性高和運(yùn)行成本低等特點(diǎn)，近年來已被廣泛應(yīng)用于土壤細(xì)菌、古菌和真菌群落組成及其多樣性研究。本研究基于Illumina Miseq二代測序技術(shù)，分析-N、-P和-K處理對(duì)冬油菜根際與非根際土壤細(xì)菌和真菌多樣性及其群落的組成結(jié)構(gòu)。表2結(jié)果顯示各處理根際和非根際土壤中細(xì)菌的豐富度和均勻度相比真菌較高，這與土壤中微生物以細(xì)菌為主有關(guān)［20］。-N和NPK處理下，根際細(xì)菌多樣性比非根際土壤高，而-P和-K處理則相反。4個(gè)處理中非根際土壤真菌多樣性均比根際土壤高，且長期養(yǎng)分缺乏對(duì)細(xì)菌和真菌的豐富度影響較為明顯。方靜等［21］研究表明，合理施用氮肥利于土壤微生物生長和微生物多樣性增加，但過量施肥會(huì)抑制微生物繁殖。崔佩佩等［22］通過氮、磷和鉀肥配施發(fā)現(xiàn)高粱根際微生物種類及微生物多樣性有所增加。此外，小麥與苜蓿、豌豆、油菜間混作種植可促進(jìn)小麥根際微生物數(shù)量增加，其中細(xì)菌數(shù)量最多，而真菌數(shù)量最少。

因此，土壤養(yǎng)分供給充足的條件下，由于擴(kuò)散作用和根系吸收，使得根際土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)比非根際土壤濃度高，加之根系分泌物的釋放誘導(dǎo)，有利于根區(qū)微生物繁殖，從而提高其豐富度和多樣性，這也印證了本文NPK處理根際微生物多樣性高，而養(yǎng)分缺乏處理根際微生物多樣性低的結(jié)果。從已有相關(guān)的研究結(jié)果得知細(xì)菌多樣性與土壤有機(jī)碳、有機(jī)氮含量正相關(guān)；而土壤真菌多為病原菌，不利于植物正常生長，可能會(huì)被植物根系主動(dòng)過濾，導(dǎo)致根際真菌多樣性比非根際低［23］。本研究結(jié)果顯示，土壤pH、有效磷和速效鉀含量對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著，而有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為明顯。對(duì)于根際與非根際土壤，李麗娟等［24］的研究表明，在植物根系的調(diào)控下，根際土中有機(jī)質(zhì)與氮素、磷素以及鉀素的相關(guān)性更為顯著，而非根際土壤中僅鉀素與堿解氮、有效磷呈顯著負(fù)相關(guān)，其余各土壤養(yǎng)分因子之間均無顯著相關(guān)性。本研究表明，與各處理非根際土壤養(yǎng)分含量相比，各處理根際土壤pH呈下降趨勢，這是因?yàn)閜H降低有利于土壤根際養(yǎng)分活化，從而出現(xiàn)有機(jī)質(zhì)、有效磷及速效鉀富集的趨勢，而緩效鉀之間差異不顯著，這與背景值含量較高有關(guān)。

3.2 長期養(yǎng)分缺乏對(duì)冬油菜土壤微群落組成的影響

從本研究結(jié)果來看，長期氮磷鉀養(yǎng)分供應(yīng)不足導(dǎo)致冬油菜根際與非根際土壤在細(xì)菌、真菌群落組成上存在顯著差異。由圖1門水平分類結(jié)果來看，各處理根際土壤細(xì)菌的Patescibacteria相對(duì)豐度高于非根際土壤，而Rokubacteria的相對(duì)豐度則相反。真菌子囊菌門在-P、-K和NPK處理根際中的相對(duì)豐度均高于非根際土壤；擔(dān)子菌門在-N1和NPK1土樣中的相對(duì)豐度均較高。同時(shí)，在圖2A屬水平分類上，各處理非根際細(xì)菌的優(yōu)勢屬種類比根際土壤顯著增加，且非根際細(xì)菌的優(yōu)勢屬相對(duì)豐度也高于根際土壤。非根際土壤的優(yōu)勢屬，如Haliangium、Solibacter和Anaeromyxobacter在 根際土壤中的相對(duì)豐度顯著降低，而Acidobacteria、Bryobacter和Gemmatimonas在根際土壤中富集并形成優(yōu)勢屬，這與前人研究相一致［25］，即根際養(yǎng)分差異會(huì)誘導(dǎo)優(yōu)勢菌群形成并與之匹配適應(yīng)。具體而言，-N處理根際綠彎菌門相對(duì)豐度高于非根際土壤，這和Francioli等［26］的研究一致。變形菌門屬富營養(yǎng)型細(xì)菌群落［27］，因此，其在NPK肥處理根際的相對(duì)豐度高于非根際，這可能與根際營養(yǎng)充足有關(guān)。

在真菌門水平上（圖1B），子囊菌門和擔(dān)子菌門均為各處理的優(yōu)勢菌門，同時(shí)這兩種真菌也是土壤有機(jī)質(zhì)分解的重要參與者［28-29］。因此，養(yǎng)分缺乏土壤和NPK處理仍以擔(dān)子菌門和子囊菌門為主導(dǎo)，這與前人研究結(jié)果相似［30-31］。尤其當(dāng)土壤養(yǎng)分供應(yīng)充足時(shí)，比較有利于富營養(yǎng)型菌群的生長；而當(dāng)土壤養(yǎng)分貧瘠時(shí)，寡營養(yǎng)菌群相對(duì)豐度有增加的趨勢［32-33］，如本文-N和-P處理下根際壺菌門和球囊菌門的相對(duì)豐度顯著高于NPK處理。

相關(guān)研究表明，根際與非根際菌群差異主要由pH和養(yǎng)分含量引起。通常條件下，根際微生物多樣性高于非根際，一方面因?yàn)楦H土壤有機(jī)碳、有機(jī)氮等養(yǎng)分含量高于非根際土，另一方面因?yàn)楦H土壤可溶性鹽含量低于非根際土，有利于特定類群增殖和提高豐度［34］。但長期肥料缺乏會(huì)加重根際營養(yǎng)不足，導(dǎo)致細(xì)菌和真菌優(yōu)勢菌群含量降低，以適應(yīng)環(huán)境脅迫。此外，增施有機(jī)肥和秸稈還田、減少化肥農(nóng)藥施用量可顯著改善土壤微生物種群的結(jié)構(gòu)。有研究指出黃土旱地區(qū)作物連作時(shí)施適當(dāng)化肥或有機(jī)肥，可提高土壤細(xì)菌多樣性［35］。不同于小麥和水稻，冬油菜進(jìn)入角果期，葉片逐漸脫落可增加土壤有機(jī)物質(zhì)，能夠?yàn)楸韺油寥牢⑸锾峁┴S富的碳源；而長期肥料供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致冬油菜地上部生物量積累下降，進(jìn)而影響土壤供碳能力和微生物繁殖。吳榮等［36］探究長期不同施肥方式對(duì)土壤微生物的影響，發(fā)現(xiàn)化肥與有機(jī)肥或者與秸稈配合施用的土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量比單施化肥的增幅效果明顯。徐忠山等［37］的研究發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥可不同程度增加細(xì)菌數(shù)量和種類多樣性，進(jìn)而使土壤系統(tǒng)向穩(wěn)定健康的方向發(fā)展。因此，科學(xué)施肥有利于提高土壤微生物細(xì)菌和真菌的多樣性，抑制優(yōu)勢菌群的形成，從而穩(wěn)定土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，長期平衡施肥條件下，油菜根際土壤的細(xì)菌多樣性比非根際土壤高，而真菌多樣性低于非根際土壤，尤其長期不施用氮肥和磷肥會(huì)顯著降低冬油菜根際細(xì)菌、真菌的豐富度。門分類水平上，油菜季土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢物種是綠彎菌門、酸桿菌門和變形菌門；真菌優(yōu)勢物種是子囊菌門和擔(dān)子菌門。相比NPK處理，-N、-P和-K處理對(duì)冬油菜根際、非根際細(xì)菌和根際真菌群落分布有顯著影響，但對(duì)非根際真菌群落分布無明顯作用。因此，長期養(yǎng)分缺乏會(huì)顯著改變冬油菜根際細(xì)菌和真菌的群落組成結(jié)構(gòu)及其多樣性。