王健，黃華，方建軍*，郭浩煒，段瑀，毛小紅

衢州市食品藥品檢驗研究院（衢州 324000）；2. 浙江江山健康蜂業(yè)有限公司（江山 324100）

蜂王漿也叫蜂乳，簡稱王漿。是工蜂頭部營養(yǎng)腺分泌的一種乳白色或淡黃色、略帶甜味并附有酸澀味的漿液[1]，富含氨基酸、糖類、有機酸等多種活性成分[2]，具有抑菌、抗氧化、抗衰老及護膚美容等其他多方面生理作用，被譽為“生命青春之源”[3]。中國是蜂王漿生產(chǎn)和出口第一大國，世界上90%以上的蜂王漿產(chǎn)自中國[4]，2019年，日本、歐盟對蜂王漿農(nóng)藥殘留限量要求提高，中國需要研究突破日本、歐盟技術壁壘的農(nóng)藥殘留檢測的法定標準，從而解決農(nóng)藥殘留問題[5]。以日本為例，進口蜂王漿需檢測氟胺氰菊酯等高風險農(nóng)藥殘留。因此，亟須從國際出發(fā)，提升檢測方法，破解技術壁壘。

農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜（GC）法[6-7]、高效液相色譜（HPLC）法[8-9]、氣相色譜-質譜（GCMS）法[10-11]、液相色譜-質譜（LC-MS）法[12-13]。這些檢測方法在一定程度上增強了對蜂王漿中農(nóng)藥殘留的質控力度，但是方法涉及的品種偏少，類別單一，前處理過程和檢測手段不同且繁瑣，現(xiàn)行標準如GB 23200.98—2016《食品安全國家標準 蜂王漿中11種有機磷農(nóng)藥殘留量的測定 氣相色譜法》和GB 23200.100—2016《食品安全國家標準蜂王漿中多種菊酯類農(nóng)藥殘留量的測定氣相色譜法》采用氣相法，存在靈敏度偏低和假陽性干擾。采用GC-MS/MS法建立一種科學、簡單、快捷、準確的檢測方法，可填補國內(nèi)蜂王漿中多種高風險農(nóng)藥殘留量檢測方法的空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 儀器與設備

8890-7000D氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀（安捷倫公司）；XS-205電子天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q超純水儀（美國密理博公司）；X1R冷凍離心機（美國賽默飛公司）。

1.1.2 標準品

雙甲脒（CAS 33089-61-1，批號G1037847，純度99.2%）、雙甲脒2,4-DMA（CAS 95-68-1，批號G147027，純度99.38%）、氯苯胺靈（CAS 101-21-3，批號G167711，純度99.70%）、克螨特（CAS 2312-35-8，批號G140573，純度99.55%）、毒死蜱（CAS 2921-88-2，批號G989695，純度99.61%）、三唑醇（CAS 55219-65-3，批號G163571，純度98.91%）、蠅毒磷（CAS 56-72-4，批號G141883，純度99.15%）、氟胺氰菊酯（CAS 102851-06-9，批號G1005521，純度97.30%），均為德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.1.3 試劑和供試品

檢測用樣品（浙江江山健康蜂業(yè)有限公司）；乙腈（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；其他化學試劑（均為分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；自制超純水。

1.2 方法

1.2.1 標準品溶液的制備

精密稱取8種標準品各約20 mg，分別置于10 mL量瓶中，以乙腈為溶劑定容至刻度，搖勻，即得每1 mL各含2 mg標準品儲備液，精密吸取各標準品儲備液適量混合，使用空白基質提取液逐級稀釋儲備液，配制成0.02，0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 μg/mL的混合標準溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱取2 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻，加入300 μL氨水，渦旋混勻，加入乙腈-三氯甲烷（1∶1，V/V）溶液10 mL，渦旋5 min，使試樣完全乳化溶解，無顆粒物，加入10 g無水硫酸鈉，劇烈振蕩3～5 min后以6000 r/min離心5 min，吸取上清液，殘渣中加入5 mL乙腈，劇烈振蕩3 min后以6000 r/min離心5 min，合并上清液，加入5 mL正丙醇，40 ℃水浴中氮氣吹干，加入1 mL乙腈復溶，過0.22 μm濾膜，用于測定。

1.2.3 儀器色譜條件

色譜柱Agilent 19091S-431 HP-5ms，15 m×250 μm×0.25 μm 2根；色譜柱溫度60 ℃保持1 min，以40 ℃/min的升溫速率升至120 min，以5 ℃/min的升溫速率升至310 ℃；載氣為氦氣，純度≥99.999%，流速1為0.866 mL/min，流速2為1.066 mL/min；進樣口溫度280 ℃；樣量1 μL；電子轟擊源70 eV；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲4 min；8種農(nóng)藥殘留其他質譜條件參數(shù)見表1。

表1 8種農(nóng)藥殘留保留時間、定量離子對、定性離子對、碰撞電壓

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

色譜柱采用Agilent 19091S-431 HP-5ms，15 m×250 μm×0.25 μm 2根，試驗采用反吹裝置將2根色譜柱串聯(lián)起來，該裝置作用是每一針進樣完成后在中間會用載氣進行反吹，將殘留污染物盡可能去除，經(jīng)過反吹可使儀器、色譜柱、離子源等部位減少殘留，提高儀器、色譜柱、離子源等使用壽命。在EI離子源的模式下，用MS2全掃描類型，將0.25 μg/mL的標液進行SCAN掃描，得到色譜圖（見圖1～圖4），確定各組分的保留時間。采用Agilent MassHunter TQ優(yōu)化程序優(yōu)化前級離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量等參數(shù)，選擇靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的離子作為定量離子。8種農(nóng)藥殘留的定量離子對、定性離子對、碰撞能量及保留時間見表1。

圖1 2, 4-DMA和毒死蜱色譜圖

圖2 氟胺氰菊酯和克螨特色譜圖

圖3 氯苯胺靈和三唑醇色譜圖

圖4 雙甲脒和蠅毒磷色譜圖

2.2 檢測方法學驗證

2.2.1 檢出限和標準曲線

在1.2.3的試驗條件下，以空白蜂王漿為基質提取液配制的系列農(nóng)藥標準質量濃度分別為0.02，0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 μg/mL的混合標準溶液，供氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀測定。以農(nóng)藥定量離子峰面積為縱坐標、農(nóng)藥標準溶液質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明：8種農(nóng)藥殘留在0.02～0.25 μg/mL具有良好線性關系，相關系數(shù)R2為0.991 7～ 0.999 0；根據(jù)檢測時的信噪比（S/N）3和信噪比（S/N）10時分別計算8種農(nóng)藥殘留的檢出限和定量限，該方法檢出限為0.003 mg/kg，定量限為0.009 mg/kg，能夠很好滿足定量分析要求（見表2）。

表2 8種農(nóng)藥殘留檢出限、定量限、相關系數(shù)

2.2.2 回收率和精密度

稱取蜂王漿空白樣品進行0.01，0.05和0.10 mg/kg 3個濃度水平添加回收率試驗，每個濃度水平平行進行3次試驗，在每個添加濃度水平選取其中1份重復測定6次進行精密度試驗。在1.2.3試驗條件下，結果顯示8種農(nóng)藥殘留在3個濃度回收率為80.7%～109.2%，精密度SRSD（n=6）為0.89%～9.74%。8種農(nóng)藥殘留回收率和精密度SRSD見表3。

表3 8種農(nóng)藥回收率、精密度、準確度

2.2.3 準確度試驗

在1.2.3試驗條件下，以添加回收率的方式添加質量分數(shù)0.05 mg/kg水平進行3次試驗，對測定含量（經(jīng)回收率校正后）平均值與真值含量進行偏差比較，GB/T27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F.5中規(guī)定在0.05 mg/kg添加質量分數(shù)下偏差范圍為-20%～10%，結果表明該方法準確度好（見表3）。

3 結論

建立氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀（GC/MS/MS）檢測蜂王漿中8種農(nóng)藥殘留的最優(yōu)檢驗方法。通過試驗驗證，8種農(nóng)藥殘留線性關系良好，相關系數(shù)R2為0.9917～0.9990，回收率為80.7%～109.2%，相對標準偏差為0.89%～9.74%（n=6），準確度在-10.1%～ 5.6%，檢出限為0.003 mg/kg。該方法具有檢出限低、靈敏度高、簡單、快捷、準確的特點，可為相關檢測機構、蜂王漿生產(chǎn)企業(yè)及出口企業(yè)提供方法參考。