錢文濤，李洪亮，楊晉輝*，王孟輝，陳靜，黨云剛

1. 蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司（北京 101100）；2. 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司（呼和浩特 011500）；3. 蒙牛乳業(yè)（北京）有限責(zé)任公司（北京 101100）

隨著我國(guó)居民生活水平的逐步提高，人們對(duì)于營(yíng)養(yǎng)攝入也逐漸重視起來(lái)。由于我國(guó)牛奶主產(chǎn)區(qū)域和消費(fèi)區(qū)域的不平衡，加之冷鏈運(yùn)輸系統(tǒng)不完善，我國(guó)市場(chǎng)上牛奶產(chǎn)品以超高溫瞬時(shí)滅菌乳（UHT）為主[1]。與巴氏殺菌工藝相比，UHT由于較高的熱加工強(qiáng)度，其牛奶產(chǎn)品中乳鐵蛋白、免疫球蛋白等對(duì)人體有益的活性蛋白含量較低[1]。為了降低乳制品加工過(guò)程的熱損傷，非熱殺菌的加工工藝成為了牛奶加工新的研究方向。超高壓滅菌通過(guò)較高的靜水壓力，破壞微生物的菌體結(jié)構(gòu)，達(dá)到殺菌目的，并最大限度地保留了食材原有的感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。此次試驗(yàn)?zāi)康脑谟诤Y選適用于生乳滅菌的超高壓加工工藝條件，通過(guò)比較不同壓力條件和維持時(shí)間的工藝組合，研究超高壓對(duì)生乳中微生物、熱敏感指標(biāo)和物理特性的影響，為超高壓牛奶產(chǎn)品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為兩個(gè)部分。試驗(yàn)一用于篩選最優(yōu)的加工條件，以微生物數(shù)量和熱敏感指標(biāo)分別作為安全指標(biāo)和牛奶熱損傷指標(biāo)，對(duì)影響超高壓加工效果的加工壓力和維持時(shí)間的兩個(gè)因素進(jìn)行篩選，選擇微生物數(shù)量最低和牛奶熱損傷最小的加工壓力時(shí)間組合，作為優(yōu)化加工條件。試驗(yàn)二用于研究超高壓加工對(duì)牛奶物理特性的影響，對(duì)不同加工壓力和時(shí)間組合下加工牛奶以及生鮮乳的粒徑、色差等指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2 樣品加工

生乳樣品由蒙牛乳業(yè)（太原）有限公司提供，采集奶罐車上的大罐樣品，樣品采集完成后，2 h內(nèi)冷藏運(yùn)送至三水河公司進(jìn)行加工，加工設(shè)備為立式加壓SSH試驗(yàn)機(jī)，容積8.8 L，壓力艙溫度設(shè)置為25 ℃。試驗(yàn)一中設(shè)備壓力分別設(shè)置為200，400和600 MPa，維持時(shí)間分別是5，30和60 min，每個(gè)加工壓力和時(shí)間的組合重復(fù)3次，即進(jìn)行3個(gè)批次生乳的加工，共計(jì)30個(gè)樣品（包括原奶）。樣品一部分送至山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行微生物學(xué)檢測(cè)，另一部分冷凍保存，送至蒙牛中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)熱敏感指標(biāo)。試驗(yàn)二中采用試驗(yàn)一優(yōu)化所得加工條件（600 MPa維持15 min），同時(shí)設(shè)置200 MPa維持15 min、400 MPa維持15 min、600 MPa維持5 min、600 MPa維持30 min等試驗(yàn)處理組，進(jìn)行3批次加工試驗(yàn)，以生乳為對(duì)照組，共計(jì)18個(gè)樣品。所有樣品冷藏條件下運(yùn)回蒙牛中心實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行物理特性的檢測(cè)。兩次試驗(yàn)中生乳成分信息由蒙牛乳業(yè)（太原）有限公司提供，如表1所示。

表1 生鮮乳成分指標(biāo)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

1.3 微生物和熱敏感指標(biāo)的檢測(cè)

牛奶樣品中微生物檢測(cè)指標(biāo)包括菌落總數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，分別采用GB 4789.2—2016[3]、GB 4789.3—2016[4]、GB 4789.10—2016[5]和GB 4789.4—2016[6]方法進(jìn)行平板檢測(cè)，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)。熱敏感檢測(cè)指標(biāo)包括乳果糖、糠氨酸、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳過(guò)氧化物酶。乳果糖和糠氨酸的檢測(cè)方法參照NY/T939—2016[7]。其中：糠氨酸的檢測(cè)采用配有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀；α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢測(cè)參照T/TDSTIA 007—2019[8]，檢測(cè)設(shè)備為配備有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀；乳過(guò)氧化物酶的檢測(cè)采用evergreen試劑盒（美國(guó)，EC401117）檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 物理特性分析

加工牛奶物理指標(biāo)的檢測(cè)包括粒徑和色差。利用Beckman Coulter LS13320激光粒度分析儀分析產(chǎn)品粒徑分布，結(jié)果以顆粒粒徑在不同尺度上的百分占比表示。色差分析通過(guò)X-riteRM200色差儀進(jìn)行分析，將樣品盛放于透明的樣品瓶中，用校正過(guò)的色差儀光源貼到外瓶壁進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)操作在避光條件下進(jìn)行，結(jié)果包括L、a、b3個(gè)參數(shù)，以生乳色澤為基準(zhǔn)，其中：L為深淺指數(shù)，ΔL＞0，顏色偏淺，ΔL＜0，顏色偏深；a為紅綠指數(shù)，Δa＞0，顏色偏紅，Δa＜0，顏色偏綠；b為黃藍(lán)指數(shù)，Δb＞0，顏色偏黃，Δb＜0，顏色偏藍(lán)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)一中，微生物數(shù)量經(jīng)過(guò)log10轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，微生物數(shù)量和熱敏感指標(biāo)含量以加工壓力和時(shí)間作為模型主效應(yīng)進(jìn)行方差分析。試驗(yàn)二中，色差數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)以試驗(yàn)分組進(jìn)行Anova分析。統(tǒng)計(jì)分析利用R軟件（V 3.6.1）完成。粒徑數(shù)據(jù)利用Unscrambler 10.4軟件進(jìn)行主成分分析，導(dǎo)出圖示進(jìn)行結(jié)果說(shuō)明。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物

試驗(yàn)中不同批次生鮮乳和加工乳中的微生物指標(biāo)如表2所示。所有產(chǎn)品中的沙門氏菌均未檢出。加工壓力極顯著影響了微生物的數(shù)量（p＜0.01）。當(dāng)加工壓力超過(guò)400 MPa時(shí)，加工中的微生物指標(biāo)顯著低于生乳；當(dāng)加工壓力為600 MPa時(shí)，樣品中大腸桿菌未檢出，三批次加工樣品中僅有一批次菌落總數(shù)為3～110 CFU/mL，金黃色葡萄球菌為2～6 CFU/mL，其余兩批次未檢出。而加工時(shí)間對(duì)微生物影響不顯著（p＞0.05），加工時(shí)間為5，30和60 min時(shí)，加工樣品間的微生物指標(biāo)并無(wú)顯著差別，但均低于生乳。

表2 超高壓加工壓力和時(shí)間對(duì)牛奶中微生物指標(biāo)的影響

有研究表明，超高壓加工的壓力在300～500 MPa，隨著殺菌壓力的升高，殺菌效果逐漸增強(qiáng)[9-11]，而加工壓力為100～200 MPa時(shí)，殺菌效果并不明顯[9]，研究得到相似的研究結(jié)果。前人研究中，加工時(shí)間對(duì)于殺菌效果的影響要小于加工壓力，隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)，殺菌效果會(huì)有所改善[9-11]，但此次研究中加工時(shí)間的效應(yīng)并未得到證明。就此次研究的試驗(yàn)結(jié)果而言，600 MPa加工條件下微生物的存活數(shù)量最低，加工時(shí)間對(duì)微生物指標(biāo)影響較小，而其他研究表明400 MPa條件下，超過(guò)30 min的加工并不會(huì)降低牛奶中微生物的數(shù)量[10]，因此，考慮到加工時(shí)間對(duì)殺菌效果可能的改善作用以及生產(chǎn)過(guò)程的時(shí)間成本，牛奶適宜的超高壓殺菌條件是600 MPa維持10～30 min。

2.2 熱敏感指標(biāo)

生乳和加工樣品中熱敏感指標(biāo)如表3所示。加工壓力對(duì)牛奶中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的濃度影響極顯著（p＜0.01）。壓力為200 MPa時(shí)，加工樣品兩種蛋白含量與生乳相似（p＞0.05）；當(dāng)壓力升至400 MPa時(shí)，加工樣品中β-乳球蛋白含量顯著低于生乳（p＜0.05）；當(dāng)加工壓力為600 MPa時(shí)，樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白均顯著低于生乳和200 MPa加工樣品中的含量（p＜0.05）。加工時(shí)間會(huì)顯著影響樣品中β-乳球蛋白含量，隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)，β-乳球蛋白濃度顯著下降（p＜0.05）；加工60 min后樣品β-乳球蛋白的平均含量為加工5 min樣品含量的53.5%。α-乳白蛋白含量隨加工時(shí)間延長(zhǎng)僅有下降的趨勢(shì)（0.05＜p＜0.1）。其他熱敏感指標(biāo)隨加工壓力和時(shí)間的變化均無(wú)顯著變化（p＞0.05）。

表3 超高壓加工壓力和時(shí)間對(duì)牛奶熱敏感指標(biāo)的影響

已有研究證明，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在加工壓力分別超過(guò)400和100 MPa就發(fā)生了變性，并且隨著加工時(shí)間延長(zhǎng)，變性程度會(huì)進(jìn)一步上升[12-13]。在此次研究中，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別在大于400 MPa和大于200 MPa的壓力條件下含量明顯降低，并且加工時(shí)間延長(zhǎng)也會(huì)造成兩種蛋白含量的降低，這與前人研究結(jié)果相一致。β-乳球蛋白對(duì)于加工壓力和時(shí)間的變化比α-乳白蛋白更為敏感，這可能是由于β-乳球蛋白含有自由巰基和更多的二硫鍵[12-13]，在壓力條件下更容易發(fā)生變性，并且α-乳白蛋白是一種金屬蛋白，與牛奶中鈣離子的結(jié)合有助于維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[14]。糠氨酸和乳果糖是牛奶在熱加工過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)和乳糖異構(gòu)化的標(biāo)志性產(chǎn)物[14]，其比乳清蛋白變性更能有效標(biāo)識(shí)牛奶的熱加工強(qiáng)度。超高壓加工在未加熱的狀態(tài)下并不會(huì)引起牛奶的熱變化，其產(chǎn)品非酶褐變程度與乳果糖含量和生乳相似[15]，研究中加工樣品糠氨酸和乳果糖含量的無(wú)顯著變化也證明了這一點(diǎn)。乳過(guò)氧化物酶活性經(jīng)常被用于估計(jì)巴氏殺菌熱加工強(qiáng)度的上限，防止過(guò)熱加工[16]。牛奶中的多數(shù)內(nèi)源酶都是耐壓的，包括乳過(guò)氧化物酶[13]。在此次研究中，乳過(guò)氧化物酶的活性未受到加工壓力和時(shí)間的影響。從熱敏感指標(biāo)角度而言，研究600 MPa加工牛奶中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、糠氨酸以及乳果糖的含量與巴殺乳更為接近，優(yōu)于UHT牛奶[16]。鑒于加工時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)降低α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量，結(jié)合超高壓的殺菌效果，此次研究?jī)?yōu)選的加工工藝條件設(shè)定為600 MPa維持15 min。

2.3 物理指標(biāo)

2.3.1 粒徑

如圖1（A）所示，超高壓加工牛奶的粒徑分布圖和生乳相似，在約0.12 μm和3.0 μm處呈現(xiàn)雙峰。與其他樣品相比，生乳在0.05～0.25 μm處的顆粒比例較高，在1.2～8.2 μm處的顆粒比例較低，而大于400 MPa加工壓力處理的牛奶的顆粒比例呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。粒徑分布的主成分分析結(jié)果如圖1（B）和1（C）所示。前兩個(gè)主成分解釋了粒徑變化94%的變異，其中PC1解釋了粒徑0.04～0.4 μm減小和粒徑1.2～5.2 μm處增大的變化（圖1C）。得分圖（圖1B）顯示生乳在PC1的得分為負(fù)，而高于400 MPa加工樣品的PC1得分為正，而200 MPa維持15 min樣品得分居于兩者之間，這表明超高壓加工壓力的增強(qiáng)使得樣品中小顆粒比例減少，大顆粒比例增加。

圖1 樣品粒徑分布圖

有研究觀察到，對(duì)于未均質(zhì)的牛奶粒徑分布呈現(xiàn)雙峰分布[17]，這與此次研究中粒徑分布曲線相似。牛奶中乳脂肪球和酪蛋白膠束的粒徑范圍分別是1～10 μm和0.01～0.1 μm[18]，因此，試驗(yàn)中0.12和3.0 μm處的雙峰可能分別對(duì)應(yīng)酪蛋白膠束和乳脂肪球的粒徑分布。600 MPa維持3 min的超高壓加工使得生乳的顆粒粒徑增大[2]，其粒徑分布曲線的變化與此次研究中所得到的結(jié)果相一致。當(dāng)超高壓的加工壓力超過(guò)250 MPa時(shí)，脂肪球傾向于集聚形成脂肪球簇，增大顆粒粒徑[19-20]。高壓加工會(huì)促使酪蛋白膠束的解體，酪蛋白顆粒比例減少[21]，而解體的酪蛋白膠束可能會(huì)吸附在脂肪球表面，增大脂肪球的粒徑顆粒的比例。

2.3.2 色差

與生乳比較，不同加工工藝條件牛奶的參數(shù)差值變化如表4所示。隨著加工壓力的升高，ΔL會(huì)逐漸降低。400 MPa維持15 min、600 MPa維持15 min和600 MPa維持30 min的加工樣品顯著低于生乳。同時(shí)高壓加工也會(huì)促使b升高，600 MPa加工樣品的b值顯著高于生乳。這表明超高壓加工使得牛奶色澤變暗變黃。L值的降低表明參與散射的酪蛋白膠束粒子數(shù)減少，伴隨著酪蛋白顆粒的解離，200～400 MPa的加工壓力促使生乳的L值迅速下降和濁度降低[13]。前人研究中，超高壓牛奶與生乳相比，黃色色澤度上升，表現(xiàn)為b值的升高和a值的降低[2,22]，此次研究結(jié)果與上述報(bào)道相一致，但參數(shù)a值無(wú)顯著變化。

表4 不同處理牛奶與生乳比較的參數(shù)差值

3 結(jié)論

在此次研究中，超高壓加工能夠有效降低生乳中的微生物數(shù)量，加工壓力起主要作用，而加工時(shí)間影響并不明顯。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量會(huì)隨著加工壓力的增大而降低，加工時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)對(duì)這兩種蛋白的變性造成影響，超高壓加工對(duì)乳中過(guò)氧化物酶以及糠氨酸和乳果糖含量并無(wú)影響。通過(guò)微生物和熱敏感指標(biāo)的篩選，將600 MPa維持15 min定為此次研究?jī)?yōu)化的超高壓加工條件。通過(guò)對(duì)加工樣品粒徑和色澤的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，超高壓加工會(huì)使牛奶中0.05～0.25 μm顆粒比例減少，1.2～8.2 μm顆粒比例增加，并且牛奶色澤變暗變黃。