陳紅惠，向德健，高明菊，楊光領(lǐng)，龔雄彪

文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院 （文山 663099）

三七葉，為五加科植物三七的葉，三七葉味稍帶苦味，不僅可用做茶飲，也可作為藥用，藥性比較溫和，且毒副作用較小。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七葉具有安神、抗氧化、抗衰老等功效[1-3]。三七葉用于治療跌打損傷、止血，研磨后敷在傷口上可以止血，功能和三七根相差不大。三七葉中除以皂苷成分為主外，還含有多酚、多糖、黃酮等活性成分[4-7]。目前，三七類(lèi)產(chǎn)品被相繼研發(fā)出來(lái)，應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，主要有生活用品類(lèi)、跌打損傷類(lèi)和臨床類(lèi)藥物，如三七牙膏[8]、三七散[9]、血塞通注射劑、血塞通膠囊等；在食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，三七葉類(lèi)產(chǎn)品也相繼出現(xiàn)，如三七葉蜂蜜龜苓膏[10]、三七葉保健軟糖、三七葉花生酥糖[11-12]、三七莖葉紅茶飲料[13]、三七葉含片[14]等。

黑曲霉是安全的發(fā)酵微生物，適用于固態(tài)發(fā)酵，可生產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、檸檬酸等，用于發(fā)酵茶，發(fā)酵出來(lái)的茶的茶性比較溫和，口感顯香甜、風(fēng)味醇厚且獨(dú)特。三七葉作為三七的副產(chǎn)物，一直沒(méi)能得到有效的開(kāi)發(fā)和利用。研究以三七葉為原料，經(jīng)過(guò)不同的制茶工藝后以黑曲霉發(fā)酵，得到三七葉發(fā)酵茶，不僅可以開(kāi)發(fā)文山地方特色資源，提高三七的利用價(jià)值，還可以提高產(chǎn)物利用率，這對(duì)拓展三七葉食品市場(chǎng)、促進(jìn)三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

三七葉產(chǎn)于云南文山；黑曲霉菌種：分離于云南普洱茶，經(jīng)多代培養(yǎng)純化后并測(cè)序鑒定。

1.1.2 試劑

蘆?。ㄉ虾Ｔ慈~生物科技有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷Rb1（上海Aladdin公司）；沒(méi)食子酸、福林酚、香草醛、冰醋酸（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；冰醋酸、高氯酸、抗壞血酸、95%乙醇（山東鑫九誠(chéng)化工科技有限公司）；Tris（上海金穗生物科技有限公司）；鄰苯三酚、鹽酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸（湖北藝康源化工有限公司）。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MB90快速水分測(cè)試儀[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；粉碎機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）；V-5100型可見(jiàn)光分光光度計(jì)（廣州滬瑞明儀器有限公司）；MJ-70-1霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 黑曲霉孢子菌懸液的制備

制作PDA培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基以及需要用到的試劑、工具全部置于無(wú)菌操作臺(tái)上，紫外線消毒30 min，確保無(wú)雜菌污染，在無(wú)菌操作臺(tái)上接種黑曲霉，放入溫度為28 ℃、水分濕度85%的霉菌培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至黑曲霉長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿為止。取出培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿，用移液管吸取5 mL生理鹽水放入黑曲霉培養(yǎng)皿中，用接種針在斜面上輕輕刮取，將菌懸液倒入盛有生理鹽水的三角燒瓶中，充分振蕩，隨后用無(wú)菌脫脂棉和漏斗過(guò)濾，除去菌絲，將菌懸液稀釋到1.0×107CFU/mL。

1.4 三七葉發(fā)酵茶的制備工藝

1.4.1 工藝流程

1.4.2 操作要點(diǎn)

原料選擇：選擇鮮嫩且小的三七葉片。

殺青：殺青有炒青與蒸青兩種[15]方式。炒青：將洗凈后的葉子瀝干水分，放入大鍋小火慢炒，并不斷地翻炒；蒸青：將瀝干水分的葉子薄薄地鋪在蒸鍋里，水蒸氣上來(lái)后放入鍋里蒸三分鐘左右抬起，蒸出來(lái)的葉子水分太高不易揉捻成型，把葉子放入30 ℃鼓風(fēng)恒溫干燥箱中干燥3～5 min拿出。

揉捻：將經(jīng)過(guò)蒸青或炒青的葉子放在簸箕內(nèi)不斷揉搓，直至成蜷條狀，不會(huì)散為止。

高溫滅菌：將揉捻好的三七葉放在溫度為105 ℃的高溫滅菌鍋內(nèi)滅菌15 min。

稱(chēng)取一定量經(jīng)滅菌處理后的三七葉茶于培養(yǎng)瓶中，壓緊，按照接種量將稀釋后的菌懸液噴灑到三七葉上，用保鮮膜密封，扎上一定數(shù)量的小孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 不同發(fā)酵條件下發(fā)酵三七葉發(fā)酵茶

1.5.1.1 不同殺青方式對(duì)三七葉發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的影響

分別取用蒸青、炒青處理過(guò)的三七茶葉（茶坯含水量為30%）各30 g放在培養(yǎng)瓶中壓緊，接種20%的黑曲霉，在30 ℃條件下發(fā)酵5，10，15，20和25 d，分別測(cè)定多酚、黃酮、皂苷的含量，并與未發(fā)酵的三七葉作對(duì)比。

1.5.1.2 不同發(fā)酵溫度對(duì)三七葉發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的影響

取30 g經(jīng)炒青后的三七葉茶（茶坯含水量為30%）放在培養(yǎng)瓶中壓緊，接種20%的黑曲霉，分別在25，30，35，40和45 ℃下發(fā)酵10 d，分別測(cè)定多酚、黃酮、皂苷的含量。

1.5.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)三七葉發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的影響

取30 g經(jīng)炒青后的三七茶葉放在培養(yǎng)瓶中壓緊，接種20%的黑曲霉，茶坯含水量為30%，在30 ℃下分別發(fā)酵5，10，15，20和25 d，分別測(cè)定多酚、黃酮、皂苷的含量，并與未發(fā)酵茶葉的理化指標(biāo)作對(duì)比。

1.5.1.4 不同接種量對(duì)三七葉發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的影響

取30 g經(jīng)炒青后的三七葉茶放在培養(yǎng)瓶中壓緊，分別接種6%，13%，20%，27%和33%的黑曲霉，茶坯含水量為30%，在30 ℃條件下發(fā)酵10 d，分別測(cè)定多酚、黃酮、皂苷的含量。

1.5.1.5 不同茶坯含水量對(duì)三七葉發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的影響

取30 g經(jīng)炒青后的三七葉茶葉放在培養(yǎng)瓶中壓緊，茶坯含水量分別為10%，20%，30%，40%和50%，接種20%的黑曲霉，在30 ℃下發(fā)酵10 d，分別測(cè)定多酚、黃酮、皂苷的含量。

1.5.2 抗氧化試驗(yàn)

1.5.2.1 超氧陰離子自由基（O2-·）清除試驗(yàn)

參考陳紅惠等[20]的方法，有輕微改動(dòng)。配制濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，調(diào)整其pH為8.2，然后分別取4.5 mL 6份置于各試管中，置于37 ℃水浴鍋中加熱20 min，加入不同質(zhì)量濃度樣品液（0.00，0.40，0.44，0.48，0.52和0.56 mg/mL）2 mL，各管分別加入0.5 mL鄰苯三酚溶液，混合并置于27 ℃水浴鍋中水浴6 min，立刻加入鹽酸1.0 mL，測(cè)量波長(zhǎng)為420 nm處的吸光度。測(cè)定對(duì)照品溶液時(shí)，鄰苯三酚用蒸餾水代替，其他樣品按照上述方式測(cè)定樣品吸光度計(jì)算清除率，用抗壞血酸作為對(duì)照。

1.5.2.2 羥基自由基（·OH）清除試驗(yàn)

取2 mL不同質(zhì)量濃度（0.28，0.32，0.36，0.40和0.44 mg/mL）的樣品液，加入硫酸亞鐵和過(guò)氧化氫溶液各2.0 mL，靜置10分鐘后，加入2.0 mL水楊酸，30 min后測(cè)定吸光度（510 nm）。對(duì)照品溶液中用蒸餾水代替水楊酸測(cè)量吸光度，其他樣品按照上述方式測(cè)定樣品吸光度計(jì)算清除率，用抗壞血酸作為對(duì)照。

1.6 主要成分的測(cè)定

皂苷的測(cè)定：采用香草醛-高氯酸比色法[16-17]測(cè)定三七葉總皂苷含量，黃酮的測(cè)定：采用三氯化鋁法[18]測(cè)定三七葉黃酮的含量，多酚的測(cè)定：采用福林酚試劑法[19]測(cè)定三七葉中的多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵條件對(duì)三七葉活性成分的影響

2.1.1 殺青方式對(duì)三七葉中活性物質(zhì)的影響

不同殺青方式對(duì)三七葉中活性物質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，炒青和蒸青處理對(duì)三七葉發(fā)酵茶中皂苷、黃酮和多酚含量均有顯著性影響（p＜0.05）。通過(guò)兩種不同殺青方式，三七葉發(fā)酵茶中活性物質(zhì)都在5～10 d內(nèi)出現(xiàn)含量增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，其各成分含量均出現(xiàn)較大程度降低，在發(fā)酵15 d時(shí)含量達(dá)到最低，然后繼續(xù)發(fā)酵含量又會(huì)有一定提高，這可能是三七葉茶經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，隨著發(fā)酵進(jìn)行，黑曲霉代謝逐漸旺盛，會(huì)消耗原料中的化學(xué)成分，加上在發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生多種胞外酶，三七葉中的皂苷、黃酮和多酚均會(huì)被氧化而導(dǎo)致含量下降。三七葉通過(guò)炒青和蒸青后發(fā)酵10 d，蒸青處理過(guò)的發(fā)酵茶皂苷含量和多酚含量略高與炒青處理的，而炒青過(guò)的發(fā)酵茶黃酮含量高于蒸青的。結(jié)合感官評(píng)價(jià)，炒青處理溫度較高，能帶來(lái)較多美拉德褐變反應(yīng)的色澤加深和豐富的香氣成分產(chǎn)生的有利結(jié)果，故殺青選擇炒青方式較好。

2.1.2 溫度對(duì)三七葉中活性物質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)三七葉中活性物質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，溫度對(duì)三七葉發(fā)酵茶發(fā)酵過(guò)程中的化學(xué)成分有很大的影響，不同發(fā)酵溫度對(duì)三七葉皂苷、黃酮有顯著性差異（p＜0.05）。隨著溫度的升高，其皂苷和黃酮含量呈先上升下降，在發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)三七葉發(fā)酵茶中皂苷和黃酮含量顯著高于其他溫度下的含量（p＜0.05），在發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)皂苷含量達(dá)到最低，而多酚含量隨著溫度的升高而緩慢增加，但上升的幅度并不大，這可能是由于40～45 ℃溫度過(guò)高，部分黑曲霉死亡，引起多酚氧化的程度減少使得多酚含量增加，綜上可知，溫度為30 ℃時(shí)為最適發(fā)酵溫度。

圖2 不同發(fā)酵溫度對(duì)三七葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)含量的影響

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)三七葉中活性成分的變化影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)三七葉中活性物質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)三七葉發(fā)酵茶發(fā)酵過(guò)程中的化學(xué)成分有極大的影響，發(fā)酵時(shí)間對(duì)三七葉皂苷、黃酮有顯著性差異（p＜0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的的延長(zhǎng)，其皂苷、黃酮含量也隨之增加，與未發(fā)酵的三七葉相對(duì)比，發(fā)酵后的茶葉的皂苷和黃酮含量都高于未發(fā)酵茶葉的皂苷含量，并在發(fā)酵第15天時(shí)皂苷和黃酮含量均達(dá)到最大，這可能是由于經(jīng)過(guò)黑曲霉發(fā)酵后，原生苷的含量降低，而極性較低的稀有皂苷含量大幅度升高，導(dǎo)致了在發(fā)酵過(guò)程中皂苷含量不斷變化[21]；三七葉茶在發(fā)酵過(guò)程中黑曲霉中的微生物消耗了三七葉茶中部分蛋白質(zhì)和淀粉，次生代謝產(chǎn)物損失較少，從而三七葉發(fā)酵茶中黃酮含量增加；而三七葉發(fā)酵茶中多酚含量呈現(xiàn)一種先減少后趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，與未發(fā)酵時(shí)茶葉的多酚含量相對(duì)比，發(fā)酵后茶葉的多酚含量普遍低于未發(fā)酵茶葉的多酚含量，從發(fā)酵第10天以后變化不大，綜上可知，發(fā)酵時(shí)間為15 d時(shí)為最適發(fā)酵時(shí)間。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)三七葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)含量的影響

2.1.4 接種量對(duì)三七葉中活性成分的變化影響

接種量對(duì)三七葉中活性物質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，接種量對(duì)三七葉發(fā)酵茶發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)變化有較大影響，接種量與三七葉發(fā)酵茶中皂苷、黃酮、多酚有顯著性差異（p＜0.05）。隨著接種量的升高，其皂苷含量也不斷上升，接種量越高，皂苷含量越高，在接種量為33%時(shí)，皂苷含量達(dá)到最高，這可能是因?yàn)殡S著黑曲霉數(shù)量的增多，極性較低的稀有皂苷含量不斷增多所致；其黃酮含量隨著接種量的升高先緩慢上升后又下降，在接種量為20%時(shí)出現(xiàn)最大值，從接種量為27%時(shí)開(kāi)始下降，并在接種量為33%時(shí)出現(xiàn)最小值；多酚含量也呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)。這可能是三七葉茶在發(fā)酵過(guò)程中黑曲霉中的生長(zhǎng)與接種量有關(guān)，也與底物成分、代謝物的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，發(fā)酵過(guò)程中消耗了三七葉中部分蛋白質(zhì)和淀粉，次生代謝產(chǎn)物損失較少，從而三七葉發(fā)酵茶中最后黃酮含量增加。綜合考慮，接種量為20%時(shí)為最適接種量。

圖4 不同接種量對(duì)三七葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)含量的影響

2.1.5 含水量對(duì)三七葉中活性成分的變化影響

含水量對(duì)三七葉中活性物質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，茶坯含水量對(duì)于三七葉發(fā)酵茶發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)變化有一定的影響，含水量與三七葉發(fā)酵茶中黃酮呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05）。隨著含水量的升高，三種活性物質(zhì)含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在含水量30%時(shí)各含量均最高，黃酮和多酚含量在含水量達(dá)50%時(shí)又有所增加，這可能是因?yàn)樗趾康母叩团c霉菌的生長(zhǎng)和酶的活性水分有關(guān)，隨著含水量的升高，原生苷的含量降低，極性較低的稀有皂苷含量大幅度升高，當(dāng)含水量超過(guò)黑曲霉生長(zhǎng)的范圍，產(chǎn)生的極性較低的稀有皂苷減少所致；在發(fā)酵過(guò)程中，三七葉茶中的蛋白質(zhì)、淀粉成分減少時(shí)，微生物利用率降低，黃酮、多酚含量升高。綜合三種化學(xué)成分的總體情況來(lái)看，含水量為30%時(shí)為最適發(fā)酵含水量。

圖5 不同含水量對(duì)三七葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)含量的影響

2.2 三七葉發(fā)酵茶抗氧化能力試驗(yàn)

三七葉中的皂苷、黃酮及多酚類(lèi)物質(zhì)均含有大量的酚羥基，可以捕獲自由基生成穩(wěn)定的半酮式結(jié)構(gòu)，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[20]。通過(guò)對(duì)不同濃度的三七發(fā)酵茶提取液進(jìn)行清除O2-·和·OH試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同質(zhì)量濃度三七發(fā)酵茶的抗氧化活性（A）O2-·（B）·OH

由圖6可知，三七發(fā)酵茶提取液質(zhì)量濃度增加時(shí)其清除O2-·和·OH的能力也增強(qiáng)，清除率與三七葉發(fā)酵茶提取液的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，在測(cè)試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.44 mg/mL時(shí)，三七發(fā)酵茶對(duì)·OH的清除率最高為45.81%。通過(guò)回歸計(jì)算得到三七發(fā)酵茶對(duì)O2-和·OH的IC50值分別為1.38和0.65 mg/mL，表明三七葉發(fā)酵茶清除O2-·和·OH抗氧化能力良好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以三七葉為原料，接種黑曲霉進(jìn)行發(fā)酵制備三七葉發(fā)酵茶，對(duì)該發(fā)酵茶在制備過(guò)程中的殺青方式、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、茶坯含水量與三七葉中活性物質(zhì)的變化關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示以上條件對(duì)三七葉中皂苷、黃酮和多酚含量均有顯著性影響（p＜0.05），綜合考慮各成分變化情況，三七發(fā)酵茶適宜采用炒青進(jìn)行殺青，在茶坯含水量為30%、黑曲霉接種量為20%、溫度為30 ℃條件下發(fā)酵15 d，有利于得到品質(zhì)較高的三七葉發(fā)酵茶，對(duì)于發(fā)酵制得的三七葉茶，表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。