徐廣，任星宇，羅川，譚秋生，鄧才富,羅敏

重慶市藥物種植研究所 中藥材質(zhì)量控制研究中心，重慶市道地藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心（重慶 408435）

皺皮木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果實(shí)，主要分布于我國安徽、山東、湖北、貴州、四川和重慶等地[1]。木瓜藥用歷史悠久，始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品，本品味酸，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有平肝舒筋、和胃化濕之功。臨床多用于濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、吐瀉轉(zhuǎn)筋、腳氣水腫等癥的治療[2]?，F(xiàn)代研究表明，皺皮木瓜是一種集藥用、食用和觀賞于一身的營養(yǎng)豐富的百益果，富含超氧化歧化酶（SOD）[3]。

中藥材質(zhì)量受產(chǎn)地、生長年限、生長環(huán)境以及采收期等眾多因素影響，質(zhì)量穩(wěn)定性會出現(xiàn)較大差異[4-7]。目前對木瓜化學(xué)成分、質(zhì)量控制、含量測定及藥理作用研究報道較多[8-10]，但對其品質(zhì)差異與主要生長環(huán)境因子相關(guān)性的研究報道較少。隨著近年來農(nóng)村特色產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整力度加大，木瓜作為藥食兩用品種在發(fā)展中備受推崇，因此研究木瓜生長環(huán)境對其內(nèi)在物質(zhì)含量的影響，揭示環(huán)境因子與其內(nèi)在物質(zhì)相關(guān)性，對皺皮木瓜產(chǎn)地適宜性具有科學(xué)的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

項目團(tuán)隊于2017年對重慶不同生態(tài)環(huán)境木瓜進(jìn)行調(diào)查采樣，采集了不同種植區(qū)的木瓜樣品及對應(yīng)植株冠幅范圍內(nèi)10～30 cm層次土壤樣品，風(fēng)干粉碎過0.850和0.150 mm篩，備用。采集樣品信息見表1。采樣時隨機(jī)選取3個地塊，每個地塊分別隨機(jī)選取3株取樣然后混合，作為一組樣品。采回的木瓜樣品分別投入90～100 ℃開水中，觀察木瓜表皮開始泛白立即撈起，然后切2～3 mm厚的薄片，于45 ℃烘干打粉，過0.250 mm篩，備用。木瓜藥材和土壤樣品編號一一對應(yīng)。木瓜樣品均由重慶市藥物種植研究所鄧才富研究員鑒定，為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles spediosa（Sweet）Nakai的果實(shí)。

表1 樣品信息

1.2 儀器和試藥

LC-20AT高效液相色譜儀（島津）；KQ-1000DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)（德國，eppendorf）；UV-2450紫外分光光度計（島津）；SPX-400-Ⅱ恒溫培育箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；METTLERAL104電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；火焰光度計（上海 FP6410）。

色譜純甲醇（成都科龍化工生產(chǎn)，批號：20130115），熊果酸、齊墩果酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號分別為110742-201622和110709-201607），甲硫氨酸（Met），黑黃素，氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT），聚乙烯吡咯烷酮（PVP），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、重鉻酸鉀、NaHCO3、NH4OAc、甲醇、冰醋酸均為分析純。

1.3 木瓜內(nèi)在物質(zhì)含量測定

熊果酸和齊墩果酸總含量測定：取約0.5 g皺皮木瓜樣品細(xì)粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 KHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：色譜柱，SHISEIDO CAPCELL PAK C18MGⅡ色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動相，甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05，V/V）；檢查波長210 nm；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

浸出物含量測定：取約2.0 g皺皮木瓜樣品細(xì)粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL乙醇，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h后連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，精密量取25 mL濾液，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，放冷，迅速精密測定質(zhì)量，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）。

1.4 木瓜SOD活性測定

1.4.1 SOD提取

稱取0.5 g鮮木瓜部位于預(yù)冷的研缽中，加2 mL提取介質(zhì)（50 mmol/L磷酸緩沖液含1%的PVP），在冰浴條件下研磨成均漿，加入提取介質(zhì)沖洗研缽2～3次，并使最終體積為10 mL，取5 mL均漿液在4 ℃條件下按10 000 r/min離心15 min，上清液即為SOD粗提液。

1.4.2 酶活性的測定

采用氮藍(lán)四唑光還原法[3]，測定560 nm下的吸光度來計算SOD活性，以抑制NBT光還原反應(yīng)50%所需的酶量為一個酶活性單位。反應(yīng)體系：Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液50 mmol/L pH 7.8；130 mmol/L Met用磷酸緩沖液配制；750 μmol/L NBT用磷酸緩沖液配制；20 μmol/L核黃素用磷酸緩沖液配制；100 μmol/L EDTA-Na2用蒸餾水配制。

式中：A0為光下對照管吸光度；AS為樣品測定管吸光度；Vt為樣品提取液的總體積，mL；VS為樣品測定取樣體積，mL；t為光照反應(yīng)時間，min；FW為鮮品質(zhì)量，g。

1.5 土壤養(yǎng)分含量的測定

土壤理化性質(zhì)指標(biāo)測定主要參照鮑士旦主編的《土壤農(nóng)化分析》中的方法。采用重鉻酸鉀容重法測定土壤有機(jī)質(zhì)；采用堿解擴(kuò)散法測定堿解氮；采用0.5 mol/L NaHCO3-鉬銻抗比色法測定速效磷；采用NH4OAc浸提-火焰光度法測定速效鉀。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

2.1.1 土壤質(zhì)地與海拔

如表1所示，采樣點(diǎn)海拔從377 m到1 349 m等不同海拔均有木瓜種植分布，說明其種植范圍海拔跨度較大。采樣點(diǎn)的土壤類型有紫色土、紫色夾沙土、紫黃泥、紫色石骨子土、紫色夾沙泥、紫色大土、礦子黃泥、灰包土、棕紫泥、黃泥等10種類型，表明木瓜種植區(qū)域廣，深受百姓喜愛。

2.1.2 土壤化學(xué)性狀

如表2所示，所有采樣點(diǎn)的pH范圍在4.60～8.05之間，土壤從酸性到微堿性跨度大。有機(jī)質(zhì)處于0.99～ 5.665 g/kg之間，平均值為2.623 g/kg，屬于六級，肥力比較貧瘠，說明皺皮木瓜在肥力比較貧瘠的土壤中能正常生長。

表2 土壤理化性質(zhì)

土壤中氮、磷、鉀的含量范圍分別是68.82～ 434.4，1.6～27.675和68.935～561.67 mg/kg；氮和鉀含量處于1～4級之間，磷含量處于2～6級之間，土壤養(yǎng)分分級跨度大，說明皺皮木瓜對土壤養(yǎng)分需求不嚴(yán)格，適應(yīng)性強(qiáng)。同時可以看出，變異系數(shù)最大的是速效磷，達(dá)0.95，其次是速效鉀、堿解氮、有機(jī)質(zhì)，變異系數(shù)分別為0.56，0.48和0.41，pH變異系數(shù)最小，為0.15。

2.2 皺皮木瓜內(nèi)在物質(zhì)含量分析

表3 皺皮木瓜內(nèi)在物質(zhì)含量

指標(biāo)成分（熊果酸和齊墩果酸）處于0.587%～ 1.552%之間，均超過藥典標(biāo)準(zhǔn)要求的不低于0.50%，其中19，23和24號樣品的熊果酸含量低于齊墩果酸含量，而其他樣品均是熊果酸含量大于齊墩果酸含量；浸出物處于35.15%～50.0%之間，也均超過了藥典標(biāo)準(zhǔn)15%的要求；同時其SOD活性都很高，最低活性1 385.38 U，最高活性1 503.33 U。方差分析表明：不同采樣點(diǎn)木瓜的熊果酸和齊墩果酸的含量存在顯著的差異（p＜0.05）。

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 生長環(huán)境因子分析

對海拔、土壤pH和N、P、K含量進(jìn)行了因子分析，提取了3個因子，總方差77.61%的貢獻(xiàn)來自這3個因子，見表4。生長因子分析散點(diǎn)圖見圖1。磷、pH與第一因子有較強(qiáng)相關(guān)性，氮、有機(jī)質(zhì)與第二因子有較強(qiáng)相關(guān)性。說明土壤養(yǎng)分對皺皮木瓜的內(nèi)在物質(zhì)含量有重要影響。

表4 因子分析總方差分解表

圖1 生長因子分析散點(diǎn)圖

2.3.2 生長環(huán)境與皺皮木瓜內(nèi)在物質(zhì)相關(guān)性分析

皺皮木瓜內(nèi)在物質(zhì)與生長環(huán)境相關(guān)性見表5。結(jié)果顯示，皺皮木瓜浸出物含量與土壤中堿解氮含量呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.486；齊墩果酸含量與生長海拔呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.487；SOD與土壤中速效鉀含量呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.410。

表5 生長環(huán)境與木瓜內(nèi)在物質(zhì)相關(guān)性分析

2.4 回歸模型的建立

為建立皺皮木瓜質(zhì)量品質(zhì)與生長環(huán)境因子關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，試驗(yàn)以熊果酸（Y1）、齊墩果酸（Y2）、浸出物（Y3）、SOD（Y4）為因變量，以生長環(huán)境因子氮（X1）、磷（X2）、鉀（X3）、pH（X4）、有機(jī)質(zhì)（X5）、海拔（X6）為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，得方程（2）～（4）：

由回歸方程可以看出：對皺皮木瓜齊墩果酸的含量影響最大為海拔高度，二者有顯著的正相關(guān)關(guān)系；土壤堿解氮與皺皮木瓜浸出物含量有顯著的正相關(guān)關(guān)系；土壤速效鉀和海拔高度與皺皮木瓜SOD活性呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)果表明，在較高海拔條件下，有利于某些內(nèi)在物質(zhì)的合成或累積，同時在生產(chǎn)中適當(dāng)增加氮、鉀肥的施用有助于內(nèi)在物質(zhì)的累積提升。

3 討論

植物次生代謝產(chǎn)物往往是在多種環(huán)境脅迫下通過某些機(jī)制調(diào)控產(chǎn)生的，土壤是植物賴以生長的物質(zhì)基礎(chǔ)，其理化特性對植物的生長發(fā)育及其次生代謝產(chǎn)物的積累都有影響。研究環(huán)境因子與藥材質(zhì)量之間的相關(guān)關(guān)系，對于指導(dǎo)開展中藥區(qū)劃和規(guī)范化種植等具有重要意義。

皺皮木瓜作為食藥兩用的木本樹體，還具有很高的生態(tài)價值，適宜的土壤類型多，海拔跨度大，生長環(huán)境多樣性，適應(yīng)性強(qiáng)。此次試驗(yàn)的因子分析中，磷、pH與第一因子有較強(qiáng)相關(guān)性；氮、有機(jī)質(zhì)與第二因子有較強(qiáng)相關(guān)性。生長環(huán)境因子與內(nèi)在物質(zhì)相關(guān)性表明，木瓜浸出物含量與土壤中堿解氮含量呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），齊墩果酸含量與生長海拔呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），SOD與土壤中有效鉀含量及海拔呈顯著正相關(guān)（p＜0.05）；土壤養(yǎng)分對皺皮木瓜生長有重要影響，而變異系數(shù)越小，土壤養(yǎng)分越穩(wěn)定、越均勻，對植物生長影響越大；變異系數(shù)：速效磷＞速效鉀＞堿解氮，同時也印證了上述中“堿解氮和速效鉀對其內(nèi)在物質(zhì)含量的生成有顯著正相關(guān)作用”的結(jié)論。進(jìn)一步證明皺皮木瓜基地的建設(shè)特別需要注意考察土壤氮素和鉀素的可供給性，或是在生產(chǎn)中注意氮肥和鉀肥的合理施用。因此在實(shí)際的生產(chǎn)布局中，可結(jié)合具體的藥用和食用飲品開發(fā)分類布局基地，以藥用為主的基地建設(shè)，在選址上應(yīng)更側(cè)重于浸出物含量、熊果酸和齊墩果酸等指標(biāo)成分的有效積累；以化工、食用飲品開發(fā)為主的基地建設(shè)，則可更側(cè)重于功能性成分SOD含量更高的區(qū)域布局。