余杰，唐勇，周書來(lái)，宋建群，應(yīng)樺

1. 樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院（樂(lè)山 614000）；2. 樂(lè)山豐野農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司（樂(lè)山 614000）

磺胺類藥物是指一類具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的藥物總稱，如磺胺嘧啶、磺胺地索辛、磺胺喹惡啉等。作為抗菌類藥物，因其具有高效、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)或動(dòng)物疾病的治療。長(zhǎng)期食用磺胺類藥物超標(biāo)的動(dòng)物源性食品，可能引發(fā)泌尿系統(tǒng)、肝臟損傷，過(guò)量的攝入更極有可能致癌[1-2]。因此，世界各國(guó)都對(duì)該類藥物在畜禽肉中的殘留制定了嚴(yán)格的限量[3]。目前磺胺類藥物的測(cè)定分析方法有酶聯(lián)免疫吸附法[4]、氣相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1-3,8-11]等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)時(shí)具有靈敏度高、選擇性好、分析效率高等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，因此該方法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織中磺胺類藥物的測(cè)定。農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008[10]實(shí)現(xiàn)了對(duì)磺胺類藥物的提取和凈化，但是仍存在有待改進(jìn)之處，如：采取旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除乙酸乙酯，不僅效率較低，且存在爆沸的現(xiàn)象；對(duì)樣品的提取不完全；加入正己烷去脂時(shí)未考慮殘留正己烷對(duì)前處理小柱的影響；只采用了甲醇稀釋制備成系列濃度的磺胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線液來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，忽略了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)磺胺類藥物的影響等問(wèn)題。結(jié)合實(shí)際情況，對(duì)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008試驗(yàn)方法做進(jìn)一步的優(yōu)化和改進(jìn)，以提升試驗(yàn)效率及準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DGU-20A-API3200超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司）；FA124電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；UPT-Ⅱ-10T超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；HSC-B氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；VM24位固相萃取柱（天津艾杰爾科技有限公司）；TGL-16高速離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（常州冠軍儀器制造有限公司）；KQ700數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器制造有限公司）。

乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；鹽酸、氨水均為分析純；試驗(yàn)用水均為超純水。

7種磺胺類藥標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺甲基嘧啶（純度99.2%，lot：C0008380，曼哈格）；磺胺甲惡唑（純度97.8%，lot：C0005164，曼哈格）；磺胺間甲氧嘧啶（純度97.0%，lot：C0005432，曼哈格）；磺胺二甲嘧啶[純度99.4%，lot：G136653，Dr.Ehrenstorer GmbH（德國(guó)）]；磺胺地索辛[純度99.4%，lot：G122608，Dr.Ehrenstorer GmbH（德國(guó)）]；磺胺喹惡啉[純度98.92%，lot：G159519，Dr.Ehrenstorer GmbH（德國(guó)）]；磺胺嘧啶[純度99.2%，lot：G140186，Dr.Ehrenstorer GmbH（德國(guó)）]。

1.2 配制

鹽酸溶液（0.1 mol/L）：量取4.15 mL濃鹽酸，用水定容至500 mL。

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取適量的磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容，配制成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，在-20 ℃冰箱中保存。

磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）：精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000 μg/mL）各10 μ，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在4 ℃冰箱中保存。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相A相為0.1%甲酸乙腈，流動(dòng)相B相為0.1%甲酸，流速為0.30 mL/min，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

掃描模式：電噴霧正離子（ESI+）。TEM：450 ℃；CUR：30 psi；CAD：5 psi；IS：4 500 V；GS1：30 psi；GS2：30 psi。Q1和Q3均為單位分辨率。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別量取適量的磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

基質(zhì)配標(biāo)工作曲線的制備：稱取5 g與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品，經(jīng)1.4.2小節(jié)提取和凈化，制成空白基質(zhì)溶液。分別取適量磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)溶液配成質(zhì)量濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和100.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

隨行加標(biāo)工作曲線的制備：稱取5 g與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品，加入系列適量磺胺標(biāo)準(zhǔn)中間液，經(jīng)1.4.2小節(jié)提取和凈化，配成質(zhì)量濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和100.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

表2 七種磺胺類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.4.2 樣品提取與凈化

提?。悍Q取5 g試樣，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙酸乙酯，在水浴恒溫振蕩器振蕩5 min，再超聲提取10 min，按5000 r/min離心10 min，分離上清液于125 mL分液漏斗中，殘?jiān)猛瑯臃椒ㄖ貜?fù)提取1次，合并乙酸乙酯層。

凈化：在上述125 mL分液漏斗中加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸，充分振蕩分液漏斗后靜置，待分層后收集下層溶液于另一50 mL離心管中，再分2次用2 mL 0.1 mol/L的鹽酸洗滌分液漏斗并再次充分振蕩，靜置分層，合并鹽酸層溶液。在含有鹽酸的50 mL離心管中加入5 mL正己烷，渦旋振蕩1 min后按10000 r/min離心5 min，吸去上層正己烷，再用3 mL的正己烷重復(fù)1次，最后用氮吹將液面殘留正己烷吹干，取下層液備用。

經(jīng)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008凈化步驟中過(guò)柱操作對(duì)上述備用液進(jìn)行過(guò)柱，收集洗脫液于45 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ葜? mL，過(guò)0.2 μm有機(jī)濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取過(guò)程

農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008規(guī)定，加入15 mL乙酸乙酯，采用渦旋2 min進(jìn)行提取，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)回收率較低。主要原因是僅使用渦旋2 min的方式進(jìn)行提取操作，目標(biāo)化合物提取不充分，導(dǎo)致回收率較低。改用加入15 mL乙酸乙酯后水浴恒溫振蕩器振蕩5 min，再超聲提取10 min作為提取部分的操作，由表3可知改進(jìn)提取方法后目標(biāo)化合物的提取效果更好，回收率明顯提高。

表3 改進(jìn)后的方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的加標(biāo)回收率的比較（n=6）

2.2 乙酸乙酯去除過(guò)程

農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008中分離乙酸乙酯和鹽酸采用的方法是水浴旋蒸。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水浴旋蒸的方法容易引起爆沸，且旋蒸操作比較耗時(shí)。改用分液漏斗，使用液液分配的方法直接分離，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作，提高了工作效率。

2.3 離心和去脂過(guò)程

農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008規(guī)定，加入正己烷按3 500 r/min離心5 min對(duì)樣液進(jìn)行去脂化，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)速較低，去脂效果不好；由于正己烷未完全去除，在進(jìn)行過(guò)柱操作耗時(shí)較長(zhǎng)。提高轉(zhuǎn)速至10 000 r/min，能使樣液更好地分層，剩余正己烷采用氮吹去除后，過(guò)固相萃取柱效率更高。

2.4 檢測(cè)靈敏度

農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008中檢出限為0.5 μg/kg，按改進(jìn)后的方法進(jìn)行提取和凈化，信噪比S/N大于3，檢出限可達(dá)到0.17 μg/kg，結(jié)果表明改進(jìn)后的方法靈敏度滿足方法要求。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇

農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008中只采用裸標(biāo)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。此方法沒(méi)有考慮到基質(zhì)效應(yīng)，試驗(yàn)的準(zhǔn)確度較差。該試驗(yàn)增加基質(zhì)配標(biāo)和隨行加標(biāo)探討樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物檢測(cè)的影響。

由表4可知，采用農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008方法的回收率最低，采用隨行加標(biāo)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的加標(biāo)回收率最高，且更接近100%。這是因?yàn)椴捎秒S行加標(biāo)消除了基質(zhì)效應(yīng)，且消除了因試驗(yàn)操作帶來(lái)的誤差。因此，采用隨行加標(biāo)方法作為試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表4 七種磺胺類藥物裸標(biāo)、基質(zhì)配標(biāo)、隨行加標(biāo)計(jì)算的加標(biāo)回收率（n=6）

接表4

3 結(jié)論

農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008對(duì)動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)有一定的指導(dǎo)作用，但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)此方法存在提取效率不高，試驗(yàn)操作耗時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)較大和標(biāo)準(zhǔn)曲線的選取和建立不好等問(wèn)題。因此，通過(guò)對(duì)方法進(jìn)行研究與探索，進(jìn)一步對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。試驗(yàn)從以下幾個(gè)方面對(duì)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008進(jìn)行了優(yōu)化：（1）探究基質(zhì)配標(biāo)和隨行加標(biāo)對(duì)回收率的影響，大大提高了方法的準(zhǔn)確度；（2）進(jìn)一步優(yōu)化對(duì)樣品的提取步驟，改用水浴恒溫振蕩器振蕩5 min，再超聲提取10 min，使樣品提取更完全；（3）凈化過(guò)程的水浴旋蒸操作直接改用分液漏斗來(lái)進(jìn)行對(duì)乙酸乙酯分離，避免水浴旋蒸可能引起溶液爆沸和耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題；（4）凈化步驟中提高離心轉(zhuǎn)速，使得樣液分層效果更好，并在取下層備用液時(shí)使用氮吹將液面殘余正己烷吹干，提高過(guò)柱的效率。綜上所述，通過(guò)對(duì)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008方法的改進(jìn)和優(yōu)化，顯著提高實(shí)際的應(yīng)用效果，對(duì)做好動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)工作具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。