白曉菲，梁東明，張艷紅，閆心怡，韓金龍，弭永生*

1. 德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（德州 253023）；2. 德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（德州 253015）

被廣泛使用的食用色素分為兩大類：人工合成色素和天然色素[1-2]。人工合成色素主要以苯、甲苯和苯胺等化工產(chǎn)品為原料，通過化學(xué)合成方法制備，通常色澤艷麗，呈色穩(wěn)定。然而，伴隨物質(zhì)水平的提高和科學(xué)研究的發(fā)展，人工合成色素潛在的毒性、致癌和致畸風(fēng)險(xiǎn)越來越受到人們的關(guān)注[3-4]。天然色素主要來源于植物組織，某些動(dòng)物和微生物也是天然色素的來源[5-7]。相對(duì)于人工合成色素，天然色素呈色自然，作為食用色素，其安全性可靠，并且具有一定的營養(yǎng)價(jià)值和藥理保健功能[8-9]。近年來，人們對(duì)天然色素的需求逐漸增長，天然色素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、日化、紡織等行業(yè)[10-12]。花色苷是一類重要的天然色素物質(zhì)，又稱花青素，廣泛存在于被子植物的花、果、葉、莖和根的細(xì)胞液中，受環(huán)境酸度和溫度等因素的影響，能夠呈現(xiàn)出紅、紫、藍(lán)等不同顏色。在生物體系中，花色苷具有吸收紫外光的功能，能夠保護(hù)細(xì)胞分化等生命過程的正常進(jìn)行。在生物醫(yī)用方面，花色苷能夠預(yù)防冠心病和心肌缺損，延緩癌細(xì)胞的生長[13-15]，具有抗菌、抗炎和抗衰老等重要生理功能[16-18]。

紫甘藍(lán)色素屬于花色苷，是一種重要的水溶性天然色素，具有色調(diào)柔和、著色力強(qiáng)、安全性高的特點(diǎn)，對(duì)酸堿變化敏感，顏色變化明顯，變色范圍廣[19-21]。另外，紫甘藍(lán)色素還具有抑菌消炎、清除氧自由基、提高視覺靈敏度等生理功能[22-23]。紫甘藍(lán)作為一種常見蔬菜，屬于十字花科蕓薹屬，其生長周期短、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、價(jià)格低、便于運(yùn)輸和貯藏，是提取花色苷天然色素的理想原料。國內(nèi)外有關(guān)紫甘藍(lán)色素的研究還不夠系統(tǒng)，色素提取方法存在操作方法復(fù)雜、大規(guī)模生產(chǎn)成本高等問題，對(duì)于紫甘藍(lán)色素的應(yīng)用研究也難以實(shí)際轉(zhuǎn)化。以市售新鮮紫甘藍(lán)作為原料，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化紫甘藍(lán)色素的水浴法提取工藝，具有操作簡單易行的優(yōu)勢(shì)，便于實(shí)現(xiàn)天然色素的大規(guī)模提取，所提取天然色素經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后，研究在不同酸堿性條件下的變色性能，開發(fā)在普通實(shí)驗(yàn)室能夠應(yīng)用的pH試紙，探索其作為酸堿滴定用指示劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紫甘藍(lán)（市售，使用前清洗干凈）；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為國產(chǎn)分析純）。

FA224C分析天平（湖南力辰儀器科技有限公司）；YP-B電子臺(tái)秤（上海力辰儀器科技有限公司）；HH-1恒溫水浴鍋（菏澤鑫源實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水多用真空泵（上海力辰儀器科技有限公司）；UV-5500紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；Hei-Vap Value HL G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；TDL-60B離心機(jī)（山東愛博科技貿(mào)易有限公司）；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)）；M150B粉碎機(jī)（浙江天喜網(wǎng)絡(luò)科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫甘藍(lán)預(yù)處理

新鮮紫甘藍(lán)切碎，在60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)中粉碎，得紫甘藍(lán)粉末，干燥避光條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紫甘藍(lán)色素提取單因素試驗(yàn)

通過測(cè)定紫甘藍(lán)色素提取液的吸光度，考察不同條件下的提取效率。紫甘藍(lán)色素在525 nm處有明顯的特征吸收峰，其吸收強(qiáng)度隨色素溶液pH變化，不同提取條件下的色素提取液需調(diào)整至相同pH后再測(cè)定其在525 nm處的吸光度，以免影響測(cè)定結(jié)果。分別考察提取劑pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效率的影響。

1.2.2.1 提取劑pH對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

分別稱取5份0.5 g的紫甘藍(lán)粉末放入小燒杯中，編號(hào)；以體積分?jǐn)?shù)20%、pH分別為1，2，3，4和5的乙醇溶液作為提取劑，按料液比1∶20 g/mL加入到小燒杯中，在50 ℃下水浴提取1 h；浸提后立即離心，吸取上清液，用pH 2的緩沖溶液將上清液稀釋10倍（取5 mL上清液到50 mL容量瓶中定容）；測(cè)定稀釋后的提取液在波長525 nm處的吸光度，選取最佳提取條件的pH。

1.2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

分別稱取8份0.5 g的紫甘藍(lán)粉末放入小燒杯中，編號(hào)；以pH 1、體積分?jǐn)?shù)分別為10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%和45%的乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶20 g/mL加入到小燒杯中，在50 ℃下水浴提取1 h；浸提后立即離心，吸取上清液，用pH 2的緩沖溶液將上清液稀釋10倍（取5 mL上清液到50 mL容量瓶中定容）；測(cè)定稀釋后的提取液在波長525 nm處的吸光度，選取最佳提取條件的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

分別稱取6份0.5 g的紫甘藍(lán)粉末放入小燒杯中，編號(hào)；以pH 1、體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶20 g/mL加入到小燒杯中，分別在50 ℃下水浴提取不同時(shí)間（10，30，60，90，120和180 min）；浸提后立即離心，吸取上清液，用pH 2的緩沖溶液將上清液稀釋10倍（取5 mL上清液到50 mL容量瓶中定容）；測(cè)定稀釋后的提取液在波長525 nm處的吸光度，選取最佳提取條件的提取時(shí)間。

1.2.2.4 提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

分別稱取6份0.5 g的紫甘藍(lán)粉末放入小燒杯中，編號(hào)；以pH 1、體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶20 g/mL加入到燒杯中，分別在不同溫度（25，35，45，55，65和75 ℃）下水浴提取2 h；浸提后立即離心，吸取上清液，用pH 2的緩沖溶液將上清液稀釋10倍（取5 mL上清液到50 mL容量瓶中定容）；測(cè)定稀釋后的提取液在波長525 nm處的吸光度，選取最佳提取條件的提取溫度。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，以紫甘藍(lán)色素的吸光度為指標(biāo)，對(duì)提取劑pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)選，各因素水平如表1所示，紫甘藍(lán)粉末均為0.5 g，料液比均為1∶20 g/mL。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.4 紫甘藍(lán)色素的酸堿變色性質(zhì)探究及pH試紙的制備

1.2.4.1 紫甘藍(lán)色素在不同pH溶液中的顏色變化

用氫氧化鈉溶液和稀鹽酸溶液分別配制pH 1，3，5，6，7，8，10，12和14的溶液，分別取2 mL不同pH的溶液于試管中，向其中加入等量的紫甘藍(lán)色素提取液，搖勻，觀察溶液顏色變化。

1.2.4.2 紫甘藍(lán)色素制備pH試紙

將濾紙剪成相等大小的濾紙條，放在濃縮后的紫甘藍(lán)色素提取液中，充分浸泡，晾干，至色素在濾紙條上著色顯著，制得紫甘藍(lán)pH試紙，在紫甘藍(lán)pH試紙上滴加不同pH的溶液，觀察試紙顏色變化。

1.2.5 紫甘藍(lán)色素作為指示劑在酸堿滴定中的應(yīng)用

1.2.5.1 強(qiáng)堿滴定強(qiáng)酸

移取25.00 mL待測(cè)鹽酸溶液于錐形瓶中，加入2～3滴濃縮后的紫甘藍(lán)色素提取液作為指示劑，搖勻，此時(shí)溶液呈紅色，用0.100 mol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定，記錄終點(diǎn)時(shí)消耗0.100 mol/L氫氧化鈉溶液的體積，計(jì)算被測(cè)鹽酸溶液濃度，使用酚酞作為指示劑進(jìn)行滴定試驗(yàn)，將使用2種指示劑的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.2.5.2 強(qiáng)酸滴定強(qiáng)堿

移取25.00 mL待測(cè)氫氧化鈉溶液于錐形瓶中，加入2～3滴濃縮后的紫甘藍(lán)色素提取液作為指示劑，搖勻，此時(shí)溶液呈黃綠色，用0.100 mol/L鹽酸溶液進(jìn)行滴定，記錄終點(diǎn)時(shí)消耗0.100 mol/L鹽酸溶液的體積，計(jì)算被測(cè)氫氧化鈉溶液濃度，使用酚酞作為指示劑進(jìn)行滴定試驗(yàn)，將使用2種指示劑的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均為3次平行，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Excel 2010、Origin 8.0、SPSS 24.0等軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取劑pH對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

如圖1所示，在其他提取條件固定的情況下，考察提取劑pH對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響。提取液pH 1時(shí)，提取紫甘藍(lán)色素效率最高，pH 2～4時(shí)，曲線變化較為平穩(wěn)，提取效率變化不明顯，pH大于4時(shí)，提取效率明顯下降，因此，初步最佳提取條件的pH為1。

圖1 提取劑pH對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

如圖2所示，在其他提取條件固定的情況下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響。乙醇體積分?jǐn)?shù)10%～30%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取率逐漸提高，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%時(shí)，紫甘藍(lán)色素提取率最高，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取率逐漸降低，因此，初步選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)30%作為最佳條件，在此條件下，可盡量減少乙醇使用量，降低提取成本，同時(shí)保證較高的提取效果。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

如圖3所示，在其他提取條件固定的情況下，考察不同提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效率的影響。隨著提取時(shí)間延長，紫甘藍(lán)色素的提取效率逐漸升高，說明延長時(shí)間能夠提高溶劑浸提效果，提取時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，提取效率最高，超過120 min后，隨著提取時(shí)間延長，提取效率有所降低，可能原因是長時(shí)間的熱處理使紫甘藍(lán)色素略有分解，因此，初步選擇120 min為最佳提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

如圖4所示，在其他提取條件固定的情況下，考察不同提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效果的影響。提取溫度在25～35 ℃時(shí)，紫甘藍(lán)色素的提取效率幾乎不變，在提取溫度35～55 ℃時(shí)，隨著溫度升高，提取效率逐漸升高，說明提高提取溫度有利于紫甘藍(lán)色素的溶出，提取溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，提取效率最高，在提取溫度55～75 ℃范圍時(shí)，提取效率略有下降，可能原因是提取溫度過高，導(dǎo)致少量紫甘藍(lán)色素降解，同時(shí)，溫度過高也不利于降低生產(chǎn)成本，因此，初步選擇55 ℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由極差分析結(jié)果可以看出，影響紫甘藍(lán)色素提取效果的因素主次順序依次為提取劑pH＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度，即提取劑pH是最主要的影響因素，提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)是次要因素，提取溫度的影響最不明顯。根據(jù)正交試驗(yàn)分析得出的最佳組合是A1B2C2D1，即提取劑pH 1、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、提取時(shí)間120 min（2 h）、提取溫度45 ℃。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 紫甘藍(lán)色素變色性質(zhì)探究試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 紫甘藍(lán)色素在不同pH溶液中的顯色情況

如表3和圖5所示，將等量紫甘藍(lán)色素加入到不同pH的溶液中時(shí)，溶液會(huì)呈現(xiàn)不同顏色，不同pH之間顏色區(qū)分明顯，基于此，紫甘藍(lán)色素可開發(fā)作為優(yōu)良的酸堿指示劑。

表3 紫甘藍(lán)色素在不同pH溶液中的顯色情況

圖5 紫甘藍(lán)色素在不同pH溶液中顏色變化

2.3.2 紫甘藍(lán)色素pH試紙的制備

如圖6所示，通過浸泡法制備紫甘藍(lán)色素pH試紙，在試紙上分別滴加pH 1，2，5，7，10，11，12，13和14的水溶液，立即觀察試紙變色情況，在不同pH條件下，試紙顯色變化明顯，與表3結(jié)果基本一致，說明所制備的紫甘藍(lán)色素pH試紙有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖6 紫甘藍(lán)色素pH試紙變色結(jié)果

2.4 紫甘藍(lán)色素作為指示劑在酸堿滴定中的應(yīng)用效果

2.4.1 強(qiáng)堿滴定強(qiáng)酸

滴定終點(diǎn)判定方法：采用紫甘藍(lán)色素作為指示劑時(shí)，滴定終點(diǎn)為滴至溶液變藍(lán)色且半分鐘內(nèi)不變色；采用酚酞作為指示劑時(shí)，滴定終點(diǎn)為滴至溶液變紅色且半分鐘內(nèi)不變色。如表4所示，以紫甘藍(lán)色素作為指示劑時(shí)所測(cè)得鹽酸濃度略低于以酚酞作為指示劑時(shí)測(cè)得的結(jié)果，分析原因可能是紫甘藍(lán)色素指示劑的滴定終點(diǎn)約pH 7，而酚酞指示劑的滴定終點(diǎn)在pH 8～10，因此，采用紫甘藍(lán)色素作為指示劑時(shí)消耗的氫氧化鈉溶液體積相對(duì)較小，測(cè)得鹽酸濃度也相應(yīng)較小。

表4 氫氧化鈉溶液滴定鹽酸溶液測(cè)定結(jié)果

2.4.2 強(qiáng)酸滴定強(qiáng)堿

滴定終點(diǎn)判定方法：采用紫甘藍(lán)色素作為指示劑時(shí)，滴定終點(diǎn)為滴至溶液變藍(lán)色且半分鐘內(nèi)不變色；采用酚酞作為指示劑時(shí)，滴定終點(diǎn)為滴至溶液變無色且半分鐘內(nèi)不變色。如表5所示，以紫甘藍(lán)色素作為指示劑時(shí)所測(cè)得氫氧化鈉濃度略高于以酚酞作為指示劑時(shí)測(cè)得的結(jié)果，分析原因與堿滴定酸時(shí)類似，紫甘藍(lán)色素作為指示劑時(shí)滴定終點(diǎn)約pH 7，而酚酞約pH 8～10。因此，采用紫甘藍(lán)作為指示劑時(shí)消耗的鹽酸體積相對(duì)較大，測(cè)得氫氧化鈉濃度也相應(yīng)較大。

表5 鹽酸溶液滴定氫氧化鈉溶液測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

以紫甘藍(lán)為原料，采用簡便易行的水浴提取法提取紫甘藍(lán)色素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)優(yōu)化天然色素提取工藝，實(shí)驗(yàn)室中最佳提取條件為含30%乙醇溶劑體系、pH 1、溫度45 ℃、時(shí)間2 h，提取方法具有生產(chǎn)成本低、操作簡單的特點(diǎn)。對(duì)色素進(jìn)行純化后，進(jìn)一步研究紫甘藍(lán)色素的酸堿變色性質(zhì)，研究表明紫甘藍(lán)色素對(duì)酸堿環(huán)境敏感，在pH 1～14的寬范圍內(nèi)具有明顯顏色變化，不同pH下的顯色區(qū)分度高，成功制備紫甘藍(lán)色素pH試紙用于溶液檢測(cè)，并將紫甘藍(lán)色素應(yīng)用于酸堿滴定試驗(yàn)中，測(cè)試結(jié)果與傳統(tǒng)酚酞指示劑相當(dāng)。紫甘藍(lán)色素作為一種優(yōu)良的水溶性天然色素，在食品、保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域展現(xiàn)潛在應(yīng)用價(jià)值，研究其提取方法和性質(zhì)具有重要參考價(jià)值。