李冬梅，楊潔，李寶玉，劉旭光，郝志明，林春華

廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學院熱帶農(nóng)林學院（廣州 510507）

酒精濫用是一個世界性的問題，據(jù)估計酗酒已成為世界第三大健康問題[1]，長期過量的不合理飲酒可導致包括酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）在內(nèi)的200多種疾病發(fā)生或病情惡化[2]。解酒產(chǎn)品的市場需求越來越大，市場上的解酒產(chǎn)品品種繁多，但口味欠佳、功能性不一[3]。采用藥食兩用中草藥治療酒精性肝病，不僅避免藥物對患者身體的傷害和不良反應，且安全性較高，目前已成為酒精性肝病治療的新方向[4]。

藤茶Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang，學名顯齒蛇葡萄，是原國家衛(wèi)計委認定的藥食同源藥材之一[5]，是我國特有的茶用、藥用植物，其主要活性成分是二氫楊梅素[6]。研究表明，二氫楊梅素具有良好的解酒和護肝功能[7-12]，而利用藤茶開發(fā)解酒功能食品的報道不多。葛花Puerariae fos，為藥食同源植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥花，始載于陶弘景所撰《名醫(yī)別錄》[13]，其主要功能成分為異黃酮類化合物[14]，是傳統(tǒng)醫(yī)學和現(xiàn)代醫(yī)學中最具代表性的解酒良物之一[15-17]。據(jù)不完全統(tǒng)計，關(guān)于葛花解酒功效在復方中的運用達21味，現(xiàn)代以葛花為主藥開發(fā)的醒酒產(chǎn)品達16種[18-19]。這些研究主要以藤茶、葛花原料為基礎(chǔ)進行開發(fā)，而以其提取物為原料開發(fā)的解酒產(chǎn)品甚少，藤茶提取物與葛花提取物聯(lián)合應用的解酒功能食品研發(fā)鮮見報道。

固體飲料因具有攜帶方便、風味獨特、速溶性好等特點，近幾年行業(yè)發(fā)展迅猛[20]。試驗以藤茶為原料，提取純化二氫楊梅素，與葛花提取物復配，通過響應面試驗獲得感官品質(zhì)較好的藤葛復合解酒固體飲料，并探討其體外解酒作用，豐富解酒產(chǎn)品的類型，為解酒功能食品的開發(fā)提供新的思路，也為藤茶、葛花的開發(fā)利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶，江西富牛生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；果膠酶（酶活≥30 000 U/g）、纖維素酶（酶活＞400 U/mg），大連美侖生物技術(shù)有限公司；葛花提取物異黃酮，西安匯林生物科技有限公司；檸檬酸、甘草酸二鉀（甜度為蔗糖150倍）、麥芽糊精，均為食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司；二氫楊梅素（DMY）標準品、氧化型輔酶Ⅰ（NAD+），純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司；乙醇脫氫酶（ADH），酶活≥300 U/mg，美國Sigma公司；海王金樽片，深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司；RU21解酒藥，美國；解酒固體飲料，主要功效物質(zhì)為酵母提取物、L-阿拉伯糖，市售；解酒固體飲料，主要功效物質(zhì)為葛根、枳椇子，市售；乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、焦磷酸鈉、明膠、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，BSA124S，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；真空干燥箱，DZF-6050，上海一恒科學儀器有限公司；超聲清洗機，SB-5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-4，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；臺式高速離心機，H/T16MM，湖南赫西儀器裝備有限公司；pH計，PB-10，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；紫外-可見分光光度計，752，上海奧譜勒儀器有限公司；自動分裝機，MAH-101，泉州閩安泓貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藤葛復合解酒固體飲料制備工藝流程

藤茶→粉碎→酶解→超聲輔助提取→抽濾→濾液→結(jié)晶→真空干燥→熱水復溶→活性炭脫色→結(jié)晶（6次）→過濾→真空干燥→二氫楊梅素

二氫楊梅素+葛花提取物異黃酮→加入輔料→混勻→干燥→殺菌→檢測→包裝→成品

1.3.2 藤葛復合固體飲料制備操作要點

1.3.2.1 藤茶二氫楊梅素的提取純化

準確稱取一定質(zhì)量過0.250 mm（60目）篩的藤茶粉末，按最佳工藝條件提?。涸?%復合酶（W果膠酶∶W纖維素酶=1∶1）、料液比1∶30（g/mL）、pH 3.0、50 ℃下酶解50 min；在超聲功率250 W、超聲溫度50 ℃下提取30 min，趁熱過濾出提取液后置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置24 h，待析出沉淀物后經(jīng)過5 000 r/min離心10 min，取沉淀物于60 ℃真空干燥至恒重，得二氫楊梅素粗提物。將二氫楊梅素粗提物用熱水復溶，加入活性炭，趁熱過濾，將濾液置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置24 h，待析出沉淀物后經(jīng)過5 000 r/min離心10 min，重復結(jié)晶6次，真空干燥至恒重，得二氫楊梅素純化物。經(jīng)測定，藤茶二氫楊梅素提取率為29.72%，純度為98.5%。

1.3.2.2 混料

將藤茶提取物二氫楊梅素、葛花異黃酮提取物、檸檬酸、甘草酸二鉀、麥芽糊精分別過0.180 mm（80目）篩網(wǎng)，按配方量稱量，備用。

1.3.2.3 干燥、滅菌

將原料與各輔料按配方量進行混合，60 ℃下干燥約12 h，至水分≤5%。固體混合料在80 ℃下殺菌5～8 min。

1.3.2.4 檢測

對滅菌好的固體飲料用熱水進行定量沖調(diào)，進行感官評定、體外解酒和抗氧化功能測定。

1.3.2.5 包裝

對滅菌好的固體飲料按照預訂規(guī)格進行定量自動分裝、封口。

1.3.3 感官品質(zhì)評價

參照GB/T29602—2013《固體飲料》感官評價標準，結(jié)合產(chǎn)品原輔料本身的感官特性，從色澤、香氣、滋味口感、組織形態(tài)4個方面進行評價，分別占25%，25%，30%和20%權(quán)重，滿分100分，組織食品專業(yè)背景10人（5男、5女）組成感官評定小組，進行評分，具體見表1。

表1 感官評定表

1.3.4 藤葛復合解酒固體飲料單因素試驗

試驗開發(fā)最小包裝為每袋2 g、最佳沖調(diào)水量為100 mL、外觀口感俱佳的沖調(diào)固體飲料，各因素添加量范圍以固體飲料粉末質(zhì)量分數(shù)表示。通過查閱相關(guān)文獻和預試驗結(jié)果，以感官評分為評價指標，設(shè)置DMY添加量分別為10.0%，20.0%，30.0%，40.0%和50.0%，葛花提取物添加量分別為5.0%，7.5%，10.0%，12.5%和15.0%，檸檬酸添加量分別為7.5%，10.0%，12.5%，15.0%和17.5%，甘草酸二鉀添加量分別為3.0%，3.5%，4.0%，4.5%和5.0%，以麥芽糊精填充至相應規(guī)格，參照1.3.1的工藝流程制成固體飲料，加入90 ℃左右100 mL水攪拌充分溶解后，進行感官評價，確定各因素的最佳用量范圍。

1.3.5 藤葛復合解酒固體飲料配方的響應面優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取DMY添加量、葛花提取物添加量、檸檬酸添加量和甘草酸二鉀的添加量為自變量，以藤葛復合固體飲料的感官評分為響應值，利用Design Expert 8.0.6.1軟件進行Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，設(shè)計四因素三水平的響應面試驗，確定藤葛復合固體飲料的最佳配比，因素水平設(shè)計如表2所示。

表2 配方優(yōu)化的響應面因素設(shè)計及水平 單位：%

1.3.6 藤葛復合固體飲料體外乙醇脫氫酶（ALD）激活作用

采用改良后的瓦勒-霍赫法（Valle & Hoch）[21]進行測定。在帶蓋的干燥試管中，加入1.5 mL 32 mmol/L的焦磷酸鈉緩沖液（pH 8.8），1.0 mL 27 mmol/L氧化型輔酶 I（NAD+）溶液，0.5 mL 11.5%（V/V）乙醇和0.1 mL 1 mg/mL樣品溶液（此次研究配方樣品1、藤茶提取物以葛花異黃酮提取物代替其余配方相同樣品2、葛花異黃酮提取物以DMY代替其余配方相同樣品3、市售解酒固體飲料樣品4和5），混勻，25 ℃水浴鍋中加蓋溫育5 min后，立即加入0.1 mL ADH（0.25 U/mL）溶液。立即在340 nm波長下測定吸光度，每隔10 s讀數(shù)1次，直至每分鐘吸光度增大值達到穩(wěn)定為止。乙醇脫氫酶活性計算法以吸光度A對時間作圖，計算A340/10 s的增加值，根據(jù)NADH在340 nm處的摩爾消光系數(shù)6.2，計算酶活力。ADH的活力以每分鐘NADH生成的納摩爾數(shù)來表示。空白組用0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液，以同濃度等體積的海王金樽、RU21作陽性對照，其余操作相同。按式（1）和（2）計算ADH激活率。

式中：E340為340 nm處每分鐘平均吸光度增大值；3.2為總反應液的體積，mL；6.2為NADH在340 nm波長下的毫摩爾消光系數(shù)；EW為每毫升酶液所含酶的含量，mg/mL。

1.3.7 藤葛復合固體飲料體外超氧陰離子清除作用

參考文獻[22]，采用鄰苯三酚法，并略作改進。在10 mL比色管中加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.2），1 mL 0.025 mg/mL樣品溶液（此次研究配方樣品1、藤茶提取物以葛花異黃酮提取物代替其余配方相同樣品2、葛花異黃酮提取物以DMY代替其余配方相同樣品3、市售解酒固體飲料樣品4和5）和2.5 mL蒸餾水，混勻，10 min后加入0.1 mL鄰苯三酚（6 mmol/L），搖勻后靜置3 min，加入0.1 mL的HCl（10 mmol/L）終止反應，以Tris-HCl緩沖液作為參比液，在325 nm下測定溶液的吸光度，記為A1，以等體積的蒸餾水代替樣品作空白，測定吸光度，記為A0，以同濃度等體積的海王金樽、RU21作陽性對照，其余操作相同。按式（3）計算清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采取SPSS 25統(tǒng)計軟件和Design Expert 8.0.6.1軟件分析，每組試驗做3個平行，試驗數(shù)據(jù)以平均值表示，多重組間比較采用One Way Anova。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，p＜0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 DMY添加量對感官品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著DMY添加量增加，感官評分先增加后降低，DMY添加量達到40.0%時，飲料感官評分最高，隨著DMY添加量繼續(xù)增大，感官評分則開始下降。這是由于DMY有獨特的苦澀味，添加量過大時，會使飲料的口感偏苦澀，影響飲料的感官評分。因此DMY添加量選擇在30%～50%。

圖1 DMY添加量對藤葛固體飲料感官評分的影響

2.1.2 葛花提取物添加量對感官品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著葛花提取物添加量增加，感官評分先增加后降低，添加量10.0%時，飲料感官評分最高，隨著葛花提取物添加量繼續(xù)增大，感官評分則開始下降。這是由于葛花提取物添加量過大時，會使飲料的色澤偏深，影響飲料的感官評分。因此選擇葛花提取物添加量7.5%～12.5%。

圖2 葛花提取物添加量對感官評分的影響

2.1.3 檸檬酸添加量對感官品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著檸檬酸添加量增加，感官評分先增加后降低，添加量15.0%時，飲料感官評分最高，隨著檸檬酸添加量繼續(xù)增大，感官評分則開始下降。這是由于檸檬酸和甘草酸二鉀可以共同中和DMY苦澀味，添加量過大時，飲料口感偏酸，影響飲料的感官評分。因此選擇檸檬酸添加量12.5%～17.5%。

圖3 檸檬酸添加量對感官評分的影響

2.1.4 甘草酸二鉀添加量對感官品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著甘草酸二鉀添加量增加，感官評分先增加后降低，添加量4.0%時，飲料感官評分最高，隨著甘草酸二鉀添加量繼續(xù)增大，感官評分開始下降。這是由于甘草酸二鉀添加量過大時，飲料口感甜膩，影響飲料的感官評分。因此選擇甘草酸二鉀添加量3.5%～4.5%。

圖4 甘草酸二鉀添加量對感官評分的影響

2.2 響應面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應面試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以DMY添加量（A）、葛花提取物添加量（B）、檸檬酸添加量（C）和甘草酸二鉀添加量（D）為自變量，以飲料感官評分為因變量（Y），進行四因素三水平響應面試驗，來確定藤葛復合固體飲料的最佳配方。試驗設(shè)計方案和結(jié)果見表3。

表3 配方優(yōu)化的響應面試驗設(shè)計及其結(jié)果

2.2.2 模型建立與方差分析

對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到回歸方程：感官評分=88.46-3.01A+0.086B+2.38C-0.067D-0.26AB+0.12AC-2.41AD+1.55BC+2.60BD+1.67CD-10.87A2-6.48B2-4.11C2-6.92D2。試驗結(jié)果的方差分析見表4。模型p值＜0.000 1，表明該模型顯著，失擬項p值為0.074 0＞0.05，不顯著，說明該模型可用，與實際情況較吻合。同時，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.967 9，說明該模型能解釋96.79%的響應值變化，模型擬合度好，可用該模型對藤葛固體飲料配方進行優(yōu)化。由F值可以看出，影響藤葛固體飲料配方的主次關(guān)系為二氫楊梅素DMY添加量（A）＞檸檬酸添加量（C）＞葛花提取物添加量（B）＞甘草酸二鉀添加量（D）。因素的一次項（A）、二次項（A2、B2、C2、D2）的影響極度顯著，一次項（C）、交互項（BD）的影響高度顯著，交互項（AD）的影響顯著，一次項（B、D）、交互項（AB、AC、BC、CD）對結(jié)果影響不顯著。

表4 配方優(yōu)化的回歸模型方差分析

2.2.3 各因素交互作用響應面分析

藤茶提取物DMY添加量（A）、葛花提取物添加量（B）、檸檬酸添加量（C）、甘草酸二鉀添加量（D）4個因素的交互作用對藤葛復合解酒固體飲料感官評分影響的響應曲面見圖5～圖10。

圖5 DMY添加量（A）與葛花提取物添加量（B）的交互作用對藤葛復合解酒固體飲料感官評分的影響

圖10 檸檬酸添加量（C）與甘草酸二鉀添加量（D）的交互作用對藤葛復合解酒固體飲料感官評分的影響

從圖5，圖6，圖8和圖10可以看出，響應面等高線圖呈圓形，3D圖中曲面的傾斜度較為平坦，表示DMY添加量與葛花提取物添加量的交互項（AB）、DMY添加量與檸檬酸添加量的交互項（AC）、葛花提取物添加量與檸檬酸添加量的交互項（BC）、檸檬酸添加量與甘草酸二鉀的交互項（CD）對結(jié)果影響不顯著。圖7和圖9中，響應面等高線圖呈橢圓形，3D圖中曲面的傾斜度均很陡峭，表示DMY添加量與甘草酸二鉀添加量的交互項（AD）、葛花提取物添加量與甘草酸二鉀添加量的交互項（BD）對結(jié)果影響均很顯著，與表4中方差分析結(jié)果基本吻合。

圖6 DMY添加量（A）與檸檬酸添加量（C）的交互作用對藤葛復合解酒固體飲料感官評分的影響

圖7 DMY添加量（A）與甘草酸二鉀添加量（D）的交互作用對藤葛復合解酒固體飲料感官評分的影響

圖8 葛花提取物添加量（B）與檸檬酸添加量（C）的交互作用對藤葛復合解酒固體飲料感官評分的影響

圖9 葛花提取物添加量（B）與甘草酸二鉀添加量（D）的交互作用對藤葛復合解酒固體飲料感官評分的影響

根據(jù)Design Expert 8.0.6.1中“Optimization”功能，得到藤葛復合解酒固體飲料的最優(yōu)配方：DMY添加量38.55%、葛花提取物添加量10.15%、檸檬酸添加量15.78%、甘草酸二鉀添加量4.03%，在此條件下模型預測藤葛復合解酒固體飲料的感官評分為89.05分，考慮到實際操作的可行性，將上述條件調(diào)整為DMY添加量38.50%、葛花提取物添加量10.00%、檸檬酸添加量16.00%、甘草酸二鉀添加量4.00%。按該配方進行3次平行試驗，制備藤葛復合解酒固體飲料，感官評分平均值為89.04分，與預測值接近。

2.3 藤葛復合解酒固體飲料體外解酒、抗氧化功能結(jié)果與分析

2.3.1 對乙醇脫氫酶（ALD）激活率的影響

表5表明，藤葛復合固體飲料ADH激活率達到175.38%，遠高于市售2款解酒固體飲料，與陽性對照海王金樽和RU21相比，對ADH的激活率略低，但無顯著性差異。試驗配方對ADH的激活率理論上應比實測值更高，原因是藤茶提取物二氫楊梅素（DMY）在ADH激活率試驗反應體系溫度（25 ℃）下溶解性降低，容易析出。由此說明藤葛復合固體飲料具有較強的解酒作用，且藤茶提取物DMY與葛花提取物異黃酮復配對ADH激活率有一定協(xié)同作用。

表5 藤葛復合解酒固體飲料體外ADH激活率結(jié)果

2.3.2 對超氧陰離子清除率的影響

人體攝入高體積分數(shù)乙醇時，ADH代謝系統(tǒng)為乙醇的主要代謝途徑，同時借助于過氧化氫酶（CAT）系統(tǒng)等進行代謝形成乙醛[23]。過氧化氫酶可催化H2O2生成水和氧，阻止H2O2與細胞有氧代謝中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基進一步生成羥自由基，從而防止自由基對細胞的損傷[24]。表6表明，藤葛復合固體飲料對超氧陰離子清除率達62.99%，遠高于市售解酒固體飲料，比陽性對照海王金樽和RU21對超氧陰離子清除率均更強，且與RU21之間有顯著性差異。由此說明藤葛復合固體飲料具有較強的超氧陰離子清除能力，可通過提高機體CAT活力，起到較好的解酒作用，且藤茶提取物DMY與葛花提取物異黃酮復配對超氧陰離子清除有一定的協(xié)同作用。

表6 藤葛復合解酒固體飲料體外超氧陰離子清除結(jié)果

3 結(jié)論

試驗以藤茶為原料，提取純化活性成分二氫楊梅素（DMY），配以葛花提取物、檸檬酸、甘草酸二鉀和麥芽糊精，研制藤葛復合固體飲料，通過單因素試驗，研究了DMY添加量、葛花提取物添加量、檸檬酸添加量和甘草酸二鉀添加量對復合固體飲料感官品質(zhì)的影響，確定了各因素的最佳水平。在此基礎(chǔ)上，通過響應面試驗對配方進行優(yōu)化，得到藤葛復合固體飲料的最佳配方：DMY添加量38.50%，葛花提取物添加量10.00%，檸檬酸添加量16.00%，甘草酸二鉀添加量4.00%，以麥芽糊精充填到2 g/袋規(guī)格，溶于100 mL熱水中。該配方?jīng)_調(diào)的固體飲料外觀形態(tài)、色澤、風味、口感均為最佳，感官評分為89.04分，與模型預測結(jié)果89.05分接近。體外解酒作用結(jié)果顯示，藤葛復合固體飲料濃度1 mg/mL時，其對ADH的激活率達175.38%，遠高于市售解酒固體飲料，與同濃度陽性對照海王金樽、RU21相比無顯著性差異。體外抗氧化功能結(jié)果顯示，藤葛復合固體飲料濃度0.025 mg/mL時，其對超氧陰離子的清除率達62.99%，遠高于市售解酒固體飲料，比同濃度陽性對照海王金樽和RU21對超氧陰離子清除率均更強，且與RU21之間有顯著性差異。該藤葛復合固體飲料富含藤茶二氫楊梅素和葛花異黃酮等活性成分，攜帶方便、制備工藝簡單、口感佳，具有較好的解酒作用，市場前景廣闊，值得開發(fā)。