章金梅，唐云，伊奎鑫，劉仁杰

浙江耕盛堂生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司（湖州 313000）

植物的綠色主要來源于葉綠素，葉綠素是植物進行光合作用產(chǎn)生的一種脂溶性色素，其分子是由2個部分組成的，即1個核心部分卟啉環(huán)和1條很長的脂肪烴側(cè)鏈，稱為葉綠素醇（phytol）。葉綠素分子的卟啉環(huán)含有4個吡咯環(huán)，通過4個甲烯基鏈接而成。鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，偏向于帶正電荷，與其相連的氮原子則偏向于帶負(fù)電荷，因而卟啉環(huán)具有極性和親水性，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合[1]。植物的葉綠素與脂蛋白結(jié)合，脂蛋白可以保護葉綠素免受植物組織內(nèi)存在的有機酸作用，使其性質(zhì)穩(wěn)定[2]。

葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，分解速度更快[1]。葉綠素降解主要有以下兩種途徑：一是由于光照、氧氣、pH、金屬離子導(dǎo)致的葉綠素內(nèi)卟啉環(huán)的中心鎂離子被氫離子取代，形成黃褐色的脫鎂葉綠素，進而脫甲酯基形成焦脫鎂葉綠素，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[3]；二是酶促反應(yīng)、脂質(zhì)氧化導(dǎo)致的葉綠素降解，酶促降解途徑主要由葉綠體中過氧化物酶-H2O2酶促降解系統(tǒng)和胞質(zhì)中的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)組成，這2種降解系統(tǒng)與活性氧含量相關(guān)[4-6]。有資料顯示，在酸性環(huán)境下，葉綠素分子中的鎂離子會被氫離子取代，從而產(chǎn)生暗綠色至綠褐色的脫鎂葉綠素，但葉綠素在堿性條件下可水解為葉綠酸（鹽）、葉綠醇及甲醇，如果鎂離子被銅、鋅離子取代，則色澤亮綠，這是加工蔬菜保綠的理論依據(jù)[7]。銅的活性比鋅高，所以在取代速度上，銅要比鋅快些[2]。多種綠色蔬菜的護綠已有較多研究：王玨琪等[8-9]在蕨菜復(fù)綠和護綠過程中對含銅和含鋅復(fù)綠劑進行應(yīng)用和研究；劉學(xué)勤等[10]在研究沙芥腌制過程護綠發(fā)現(xiàn)，漂燙溫度75～80 ℃、硫酸銅700 mg/kg+葡萄糖酸鋅500 mg/kg、漂燙2 min對沙芥的護綠效果最好；在以海帶為原料的研究中，康三江等[11-12]對野生苣荬菜護綠過程中葉綠素保留率進行多因素試驗，其最佳護綠工藝條件為護色液pH8、燙漂時間60 s、植酸鈉質(zhì)量濃度0.1 g/L。國外對于護綠的過程也都是選用金屬離子取代葉綠素中的鎂離子進行的[13-16]，選擇合適的燙漂時間及溫度是綠色蔬菜的品質(zhì)得以保護和長期存放[17]的基本條件。所以，在現(xiàn)行的綠色蔬菜護綠加工過程中，燙漂工藝常與金屬離子取代法相結(jié)合[18]。

竹筍作為一種綠色森林蔬菜，富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、氨基酸、礦物質(zhì)、無機鹽等多種營養(yǎng)成分[6]，受到消費者歡迎。鮮竹筍貯藏時間短，故常被加工成筍干、水煮筍罐頭、腌制筍等食品。竹筍在腌制或熱加工過程中，葉綠素容易被氧化和變色，因此傳統(tǒng)的加工方式難以維持小竹筍原本的綠色，市面上大多數(shù)的綠竹筍，有使用葉綠素銅鈉鹽染色，也有使用日本進口復(fù)綠劑復(fù)綠，前者染色效果不好，容易造成筍肉染成綠色，后者只適合在腌制品中使用，成本較高。含鋅復(fù)綠劑的復(fù)綠效果雖然沒含銅復(fù)綠劑好，但鋅的安全性較銅要高，鋅可作為營養(yǎng)強化劑使用，是人體不可缺少的元素，但是過多也會對人體的健康造成不良影響。通過小竹筍復(fù)綠前后色差顏色的比較，并用火焰原子吸收分光光度計對終產(chǎn)品鋅元素含量進行測定，探索醋酸溶液對產(chǎn)品中鋅含量的影響，從而確定含鋅復(fù)綠的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原輔料

新鮮綠色小竹筍（采摘時間3—4月，原料產(chǎn)地安徽滁州，選擇組織脆嫩、粗壯、無蟲害、無腐敗變質(zhì)的小竹筍）；去殼后表皮為綠色的竹筍（廣德向陽生態(tài)食品有限公司）；腌制小竹筍（將去殼新鮮小筍清洗，加鹽漂燙后，腌制，加鹽量16%）。

1.1.2 試劑

食品級片堿；D-異抗壞血酸鈉；檸檬酸鋅；冰醋酸（杭州勝東貿(mào)易有限公司）；鋅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（基準(zhǔn)試劑，質(zhì)量濃度1 000 mg/L）。

1.2 儀器與設(shè)備

測色色差儀（WSC-S，上海笛柏實驗設(shè)備有限公司）；原子吸收分光光度計（島津AA-6300C，日本島津制作所）；微波消解儀[MD8H，奧普樂科技集團（成都）有限公司]；石墨消解儀[GD-25，奧普樂科技集團（成都）有限公司]；雷磁（PHS-3E，上海儀器科學(xué)儀器股份有限公司）；電子天平[BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗工藝流程

通過前期預(yù)試驗比較，確定最優(yōu)的生產(chǎn)工藝流程和復(fù)綠劑。

腌制小竹筍復(fù)綠：腌制原料清洗脫鹽→用檸檬酸鋅溶液浸泡過夜→在偏堿性溶液中預(yù)煮→冷卻→包裝加入D-異抗壞血酸鈉溶液→高溫殺菌→儲存。

新鮮小竹筍護綠：新鮮原料加鹽熱燙→換水在偏堿性的檸檬酸鋅溶液中預(yù)煮→冷卻→包裝加入D-異抗壞血酸鈉溶液→高溫殺菌→儲存。

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1 原料前處理

將腌制好的小竹筍，清洗脫鹽，挑選出蟲筍、傷筍，修去基部粗老部分，備用。

1.3.2.2 復(fù)綠過程

每組試驗取100 g清洗后小筍，檸檬酸鋅復(fù)綠液按照各因素水平配制500 mL。設(shè)定不同漂燙溫度（T）、復(fù)綠液質(zhì)量濃度（N）、預(yù)煮液pH的因素水平，初期試驗篩選出漂燙時間20 min時復(fù)綠效果最佳。檸檬酸鋅復(fù)綠液質(zhì)量濃度0.3 g/L、漂燙溫度80 ℃時，預(yù)煮液pH分別為6，7，8，9和10；檸檬酸鋅復(fù)綠液質(zhì)量濃度0.3 g/L、預(yù)煮液pH 8時，漂燙溫度分別為60，70，80，90和100 ℃；漂燙溫度80 ℃、預(yù)煮液pH 8時，檸檬酸鋅復(fù)綠液質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 g/L，單因素試驗結(jié)束后，取各因素最優(yōu)3組條件進行L9(33)正交試驗，每組試驗參數(shù)平行2次。通過色差儀對設(shè)定試驗的結(jié)果進行顏色測定，并用火焰原子吸收分光光度計測定鋅元素含量。根據(jù)篩選出的最優(yōu)試驗濃度、pH和漂燙溫度對新鮮小竹筍的護綠效果進行驗證，同時驗證1.5 g/L醋酸溶液浸泡可降低復(fù)綠小筍中鋅含量的結(jié)論[17]。

1.3.3 檢測方法

1.3.3.1 色澤測定

將每組樣品試驗后的樣品用清水冷卻，添加一定濃度的D-異壞血酸鈉，真空包裝成固形物80%的成品，高溫殺菌（117 ℃，35 min），冷卻后開袋用色差儀[19-20]直接檢測，每個樣品選取部位相同，平行測定2次，取平均值作為單個樣品的測定結(jié)果。儀器顯示參考量設(shè)定為Lr*=91.24，ar*=-0.87，br*=3.90，根據(jù)測得的明度、偏紅綠程度和偏黃藍(lán)程度作為篩選依據(jù)，進一步進行正交試驗，確定最佳復(fù)綠試驗條件。

1.3.3.2 鋅元素含量測定[21]

鋅元素火焰原子吸收光譜法儀器工作條件：波長213.9 nm，狹縫0.2 nm，燈電流3～5 mA。燃燒頭高度3 mm，空氣流量9L/min，乙炔流量2L/min。

鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取1.00 mL購置的鋅標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000 mg/L）于容量瓶中，加硝酸溶液（5+95，體積比）至刻度，混勻。分別準(zhǔn)確吸取2.00，4.00，6.00，8.00和10.00 mL于100 mL容量瓶中，加硝酸溶液（5+95，體積比）至刻度，混勻。此鋅標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度分別為0.200，0.400，0.600，0.800和1.000 mg/L。將鋅標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照質(zhì)量濃度由低到高的順序分別導(dǎo)入火焰原子化器，原子化后測其吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 鋅離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品處理：準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.001 g）試樣于微波消解罐中，加入6 mL硝酸消解。冷卻后取出消解罐，在石墨消解儀上趕酸至1 mL左右，待消解罐放冷后，將消化液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，并用少量水洗滌消解罐2～3次，合并洗滌液于容量瓶中，用水定容至刻度，混勻備用。每組樣品平行2次，取平均值，同時做試劑空白試驗。

2 結(jié)果和分析

2.1 單因素試驗復(fù)綠后色澤的測定結(jié)果與分析

色差儀檢測結(jié)果中，L*代表試樣明度（0為黑，100為白），a*正數(shù)代表試樣偏紅，a*負(fù)數(shù)代表試樣偏綠，b*正數(shù)代表試樣偏黃，b*負(fù)數(shù)代表試樣偏藍(lán)。因綠竹筍呈綠色或黃綠色，對亮度的干擾較大，所以L*值不精確，試驗只考慮a*和b*值。

2.1.1 不同pH預(yù)煮液試驗結(jié)果

從圖2和圖3可看出，預(yù)煮液呈弱酸性pH6時，小竹筍偏綠效果不明顯，與文獻報道介質(zhì)H+濃度的下降有利于卟啉環(huán)中的H+被Zn2+取代一致[22]。孫鶴等[23]對綠色蔬菜汁中葉綠素的穩(wěn)定性研究也表明，葉綠素在pH為中性偏微酸（堿）時最穩(wěn)定。隨著預(yù)煮液pH的升高，小筍偏紅綠程度呈下降趨勢（即偏綠結(jié)果越來越明顯），偏黃藍(lán)程度也呈下降趨勢（即偏黃結(jié)果越來越不明顯），且在pH7時，小筍色澤已達到要求，故選取pH7，8和9這3個水平進入正交試驗。

圖2 預(yù)煮液pH單因素試驗偏紅綠程度結(jié)果

圖3 預(yù)煮液pH單因素試驗偏黃藍(lán)程度結(jié)果

2.1.2 不同預(yù)煮溫度試驗結(jié)果

從圖4和圖5可見，預(yù)煮液pH8、檸檬酸鋅溶液質(zhì)量濃度0.3 g/L時，隨著預(yù)煮液溫度升高，小筍偏紅綠和偏黃藍(lán)程度呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，且在預(yù)煮液溫度為80 ℃時，小筍的綠色達到最大值，復(fù)綠效果最佳，預(yù)煮液溫度70 ℃時，小筍色澤達到要求，故選擇70，80和90 ℃這3個水平進入正交試驗。

圖4 溫度單因素試驗偏紅綠程度結(jié)果

圖5 溫度單因素試驗偏黃藍(lán)程度結(jié)果

2.1.3 不同檸檬酸鋅濃度試驗結(jié)果

由圖6和圖7可知，在預(yù)煮液pH8、預(yù)煮溫度80 ℃條件下，隨著復(fù)綠劑濃度增加，小筍偏紅綠程度呈現(xiàn)下降趨勢（即偏綠結(jié)果越來越明顯），偏黃藍(lán)結(jié)果也呈現(xiàn)下降趨勢（即偏黃結(jié)果越來越不明顯），且檸檬酸鋅質(zhì)量濃度達到0.2 g/L時，小筍的色澤達到要求，故選擇檸檬酸鋅質(zhì)量濃度為0.2，0.3和0.4 g/L這3個水平進入正交試驗。

圖6 檸檬酸鋅單因素試驗偏紅綠結(jié)果

圖7 檸檬酸鋅單因素試驗偏黃藍(lán)結(jié)果

2.2 正交試驗色澤測定結(jié)果與分析

通過小筍各組復(fù)綠的單因素試驗結(jié)果，進入正交試驗，結(jié)果如表1和表2所示。

表1 小筍正交試驗偏紅綠程度結(jié)果

表2 小筍正交試驗偏黃藍(lán)程度結(jié)果

試驗結(jié)果中，在偏紅綠和偏黃藍(lán)程度值中，試驗組第5組結(jié)果最好，正交試驗對于小筍復(fù)綠條件最優(yōu)組合為正交試驗第5組A2B2C3，但a*值和b*值的K值檢驗均顯示漂燙pH條件對于復(fù)綠效果的影響更顯著，K值檢驗后最優(yōu)為A2B3C3，以A2B3C3為試驗條件再次進行試驗，結(jié)果為a*=-20.32±0.68，b*=66.78±1.32，均不如正交試驗最優(yōu)組，所以經(jīng)過試驗及驗證可得，小筍復(fù)綠最優(yōu)工藝為漂燙溫度80 ℃、漂燙液pH 8、復(fù)綠劑質(zhì)量濃度0.4 g/L。

2.3 鋅元素含量測定結(jié)果與分析

雖然根據(jù)試驗結(jié)果得出復(fù)綠過程最優(yōu)組合，但試驗旨在通過復(fù)綠后鋅元素含量進一步確定復(fù)綠劑復(fù)綠過程最優(yōu)組合。正交試驗中各試驗組鋅含量見表3。

2011年《食品中鋅限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》廢止，且現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中未對竹筍中鋅含量作出明確規(guī)定，GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中也未把鋅作為污染物指標(biāo)[24]，參考LY/T 1673—2006《山野菜》中對鋅的規(guī)定為≤50 mg/kg，建議竹筍罐頭中鋅含量控制在50 mg/kg以內(nèi)。由表3可知，所有試驗組的鋅含量結(jié)果均在50 mg/kg以內(nèi)。

表3 各試驗組鋅元素含量測定結(jié)果

2.4 用1.5 g/L醋酸溶液浸泡對比結(jié)果

對醋酸溶液浸泡可降低鋅含量的驗證，選用預(yù)煮液pH8、預(yù)煮溫度80 ℃、檸檬酸鋅0.4 g/L，用1.5 g/L的醋酸溶液浸泡和清水浸泡對照，檢測鋅含量的結(jié)果見表4。

表4 不同浸泡液處理后樣品中的鋅含量

由表4可知，復(fù)綠后用1.5 g/L醋酸溶液浸泡后包裝殺菌，在同等條件下，鋅含量較清水浸泡降低42.4%?？稍诖_保復(fù)綠的情況下，用醋酸溶液浸泡復(fù)綠后的小筍可降低鋅含量。

2.5 新鮮小竹筍復(fù)綠效果驗證

用上述試驗得到的影響因子對新鮮小竹筍護綠進行驗證，用3%鹽水溶液預(yù)煮5 min，冷卻后用pH 8，0.4 g/L的檸檬酸鋅溶液恒溫至80 ℃，預(yù)煮20 min，冷卻后包裝，加入D-抗壞血酸鈉溶液，高溫117 ℃，殺菌35 min，可保持竹筍的綠色，a*=-20.33±0.54，b*=62.20±1.08。添加D-抗壞血酸鈉溶液的樣品較不添加的樣品，綠色保持更持久。

3 討論與結(jié)論

小竹筍護綠復(fù)綠原理都是葉綠素中的鎂原子被穩(wěn)定性更好的鋅原子所取代，由于葉綠素鎂的不穩(wěn)定性，在光照、高溫、腌漬過程中都容易被氫離子取代，在處理新鮮小筍時，先用加鹽漂燙方式將鎂離子游離出來，再用含鋅的化合物提供鋅離子與脫鎂葉綠素結(jié)合是可行的。

在小筍復(fù)綠過程中，不應(yīng)單純依靠復(fù)綠后色澤變化的最佳值來判定復(fù)綠劑的最佳濃度，應(yīng)結(jié)合小筍本身的顏色、腌制過程中的氧化程度，以及產(chǎn)品最終的鋅含量來確定工藝的最優(yōu)組合。試驗主要以腌制小筍為原料探索檸檬酸鋅在小筍復(fù)綠過程中的可行性工藝及最優(yōu)工藝參數(shù)，新鮮小筍僅進行工藝上的驗證，后期對于新鮮小筍的研究更具生產(chǎn)價值，不僅可降低生產(chǎn)成本，而且可減少腌制廢水的排放。

試驗證明，葉綠素鋅的穩(wěn)定性優(yōu)于葉綠素鎂，在117 ℃高溫殺菌后，仍能保持綠色，經(jīng)過后期試驗添加D-抗壞血酸鈉的竹筍罐頭，葉綠素的穩(wěn)定性更好，透明包裝袋在自然光照的情況下，能保持6個月不變色。復(fù)綠劑選用檸檬酸鋅時，腌制小竹筍復(fù)綠的最優(yōu)工藝參數(shù)為檸檬酸鋅質(zhì)量濃度0.4 g/L，預(yù)煮液pH 8，預(yù)煮溫度80 ℃。在此條件下，能生產(chǎn)出綠色、鋅含量＜50 mg/kg的小竹筍罐頭。