胡濱濱，張 明

(蘇州大學(xué)附屬高郵醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 高郵 225600)

表觀遺傳學(xué)是研究可逆、可遺傳的表型變化，不涉及核DNA序列的變化[1]。雖然表觀遺傳學(xué)的全部范圍尚未確定，但其一般含義是指化學(xué)修飾主要包括DNA、RNA甲基化，組蛋白修飾以及非編碼RNA修飾和染色質(zhì)重排。在表觀遺傳修飾中，DNA甲基化和組蛋白修飾得到了很好的研究，例如DNA中的5-甲基胞嘧啶甲基化已經(jīng)在多種腫瘤中影響著基因表達(dá)。近些年的對(duì)于甲基化藥物的研究已經(jīng)取得明顯的進(jìn)展，如去甲基化藥物地西他濱和阿扎胞苷，以及組蛋白去乙酰化酶抑制劑塞達(dá)明，為治療臨床疾病提供了更多策略[2-3]。而對(duì)于RNA，已經(jīng)在生物體中鑒定了100多種RNA的修飾[4]，RNA甲基化是RNA修飾的主要形式，廣泛存在于各種類型的RNA中，如rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA以及mRNA中。特別是mRNA的N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾是哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的必需調(diào)節(jié)因子[5-6]。其他修飾如5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)和N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine，m1A)[7]。其中，m6A修飾約占mRNA修飾的80%，近年來廣泛被關(guān)注和研究。RNA m6A修飾是可逆的，其生物學(xué)效應(yīng)主要通過“編碼器”，“擦碼器”和“讀碼器”蛋白介導(dǎo)[8]。編碼器是將甲基化修飾“寫入”RNA的過程，即介導(dǎo)RNA的甲基化修飾的過程，包括METTL3(Methyltransferase-like 3)、METTL14(Methyltransferase-like 14)、WTAP(Wilms tumor suppressor-1-associated protein)和ZC3H13(Zinc finger CCCH-type containing 13)[9]。 擦碼器可以“擦除”RNA甲基化修飾信號(hào)，即介導(dǎo)RNA的去甲基化過程，包括FTO(Fat mass and obesity-associated protein)和ALKBH5(Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5)[10-11]。讀碼器負(fù)責(zé)“讀取” RNA甲基化信息并參與下游RNA的翻譯和降解，包括YTHDC1(YTH domain-containing 1)、YTHDC2(YTH domain-containing 2)、YTHDF1(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1)、YTHDF2(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 2)和HNRNPC(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)[12]。越來越多的體外和體內(nèi)研究揭示了m6A甲基化修飾在調(diào)節(jié)多種生物過程中的起到關(guān)鍵的作用，包括精子發(fā)生[13]、神經(jīng)發(fā)生[14]、性別決定[15-16]等。異常m6A修飾在不同類型癌癥的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[17]，尤其是作為乳腺癌[18]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[19]和白血病的癌干細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑[20]。異常的m6A修飾對(duì)癌癥的生長(zhǎng)和進(jìn)展至關(guān)重要，這表明m6A修飾途徑可能是癌癥治療的一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)。

肺癌是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，5年生存率僅為16.6%[21]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%。在NSCLC中，兩種主要亞型是肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鱗狀細(xì)胞癌(Lung squamous cell carcinoma，LUSC)，分別占病例的50%-60%和30%。越來越多的研究表明，異常的m6A 甲基化在包括肺癌在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。去年Li[22]等人通過TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)來探討m6A調(diào)節(jié)劑分子與肺腺癌的關(guān)系，本研究與Li等人的研究部分相類似，同樣也探討了m6A甲基化分子的表達(dá)情況。但與之不同的是，接下來的研究是按照各個(gè)分子是否與生存相關(guān)進(jìn)行。為證實(shí)研究的可靠性，對(duì)GEO(Gene Expression Omnibus)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來進(jìn)一步驗(yàn)證，從而試圖揭示肺腺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，有助于助開發(fā)新的有效靶向治療方案。

1 材料和方法

1.1 RNA-seq數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析

從TCGA肺腺癌癌項(xiàng)目官方網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)下載基因表達(dá)數(shù)據(jù)(535例腫瘤組織和59例正常肺組織，數(shù)據(jù)類型：HTSeq-FPKM)和相應(yīng)的臨床信息。排除正常肺織樣本，使用箱形圖顯示離散變量的表達(dá)差異[23]。最后，522例肺腺癌患者和臨床資料)的RNA-Seq基因表達(dá)水平3 HTSeq FPKM數(shù)據(jù)并進(jìn)一步分析。

1.2 統(tǒng)計(jì)分析

用limma軟件包分析了535例腫瘤組織和59例正常肺組織中12個(gè)編碼已知m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的基因的表達(dá)情況(FC>1、p<0.05；logFC<0 的差異表達(dá)基因?yàn)橄抡{(diào)基因，logFC>0 的差異表達(dá)基因?yàn)樯险{(diào)基因)。提取這12個(gè)基因的表達(dá)矩陣和與樣品相關(guān)的臨床信息。使用R中的pheatmap、vioplot和corrplot軟件包生成熱圖、小提琴圖和表達(dá)相關(guān)圖。使用Kaplan-Meier方法分別計(jì)算12個(gè)m6A調(diào)節(jié)劑表達(dá)與肺腺癌患者的生存曲線。使用Cox回歸與TCGA患者的總體存活相關(guān)的臨床病理學(xué)特征。使用危險(xiǎn)比(HRs)超過1表示為危險(xiǎn)基因，而HRs<1表示保護(hù)基因。Cox回歸分析用于比較HNRNPC/YTHDF2的表達(dá)對(duì)生存率的影響以及其他臨床特征(年齡、分期、組織浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài))。最后，采用kruskal(KS)檢驗(yàn)和logistic回歸評(píng)估臨床因素與HNRNPC表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。缺失的臨床數(shù)據(jù)通過列表刪除進(jìn)行處理；如果缺少任何參數(shù)的值，則整個(gè)樣本將從分析中排除。OS的定義是從診斷日期到死亡日期的時(shí)間間隔。基因高、低表達(dá)是基于中位數(shù)確定的。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R軟件(V.3.5.1)進(jìn)行。

1.3 使用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)進(jìn)行驗(yàn)證

為了確保TCGA隊(duì)列結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的GSE68465驗(yàn)證HNRNPC表達(dá)水平。數(shù)據(jù)集包括443個(gè)肺腺癌和19個(gè)相鄰的非腫瘤組織樣本。以及來驗(yàn)證HNRNPC是否是肺腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

2 結(jié)果分析

2.1 TCGA隊(duì)列中肺腺癌患者的臨床病理學(xué)特征

2020年6月從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了522個(gè)具有臨床和基因表達(dá)數(shù)據(jù)的原發(fā)性腫瘤(見表1)。診斷時(shí)的中位年齡為67歲。研究發(fā)現(xiàn)臨床I期有279例(54.3%)，II期124例(24.1%)，III期85例(16.5%)和IV期26例(5.1%)。組織浸潤(rùn)為T1的有172例(33.1%)，T2的有281例(54.1%)，T3的有47例(9.1%)，T4的有19例(3.7%)。510例中有175例(34.3%)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。378例中有25例(6.7%)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。中位隨訪時(shí)間為18.3個(gè)月(范圍0～227個(gè)月)。

表1 肺腺癌患者的臨床病理學(xué)特征Table 1 Clinicopathological features of lung adenocarcinoma

2.2 RNA m6A甲基化相關(guān)基因在肺腺癌中的表達(dá)

考慮每種RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)劑在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的重要生物學(xué)功能。首先，比較了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中535個(gè)肺腺癌組織和59個(gè)正常肺組織中12種RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平。與正常肺組織相比，其中在肺腺癌組織中HNRNPC、YTHDF3、METTL3、YTHDF1、YTHDF2是相對(duì)高表達(dá)的，WTAP、FTO、ZC3H13、METTL14是低表達(dá)(見圖1a～1b，表2，p<0.05)。不同RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)劑的相關(guān)比率從弱到強(qiáng)相關(guān)(見圖1c)。大多數(shù)RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)因子之間的關(guān)系呈是正相關(guān)的，但是FTO和HNRNPC是呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的。在這些基因中METTL14和YTHDC1基因最為相關(guān)，即當(dāng)METTL14基因表達(dá)上調(diào)時(shí)、YTHDC1基因表達(dá)很有可能上調(diào)(見圖1c)。

表2 RNA m6A調(diào)節(jié)劑的表達(dá)Table 2 Expression of RNA m6A regulators

圖1 RNA m6A甲基化相關(guān)基因在肺腺癌和正常肺組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of RNA m6A methylation regulators in lung adenocarcinoma and normal tissues

2.3 生存結(jié)果和Cox回歸分析

除去正常肺組織對(duì)照組后，繪制肺腺癌中所有差異表達(dá)的m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的生存曲線。發(fā)現(xiàn)僅僅YTHDF2和HNRNPC的表達(dá)與肺腺癌患者生存相關(guān)，即YTHDF2的高表達(dá)有更好的生存、HNRNPC低表達(dá)有更好的生存(見圖2)。

圖2 TCGA隊(duì)列中所有差異表達(dá)的m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的生存曲線 Fig.2 Survival curve of all differentially-expressed m6A methylation regulators in TCGA cohort

采用單因素Cox回歸分析顯示HNRNPC的表達(dá)與總體生存相關(guān)([HR]:1.012 046 411；95%CI:1.000 432 8-1.023 794 84；p=0.042)(見表3)。與生存相關(guān)的其他臨床病理變量包括臨床分期、組織浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(見表3)。雖然在前文所述Kaplan-Meier生存分析表明，YTHDF2高表達(dá)組預(yù)后好于YTHDF2低表達(dá)組(p=0.029)，但是通過單因素Cox回歸結(jié)果表明YTHDF2的表達(dá)與肺腺癌患者生存關(guān)系不大(見表4)。

表4 使用Cox回歸的TCGA患者與總體存活和臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)及變量選擇后的多因素生存模型(YTHDF2) Table 4 Association of TCGA patients with overall survival and clinicopathological features using Cox regression and multivariate survival model after variable selection (YTHDF2)

隨后對(duì)這兩個(gè)基因行多因素Cox回歸分析，結(jié)果表明僅僅HNRNPC的表達(dá)以及臨床分期可以作為生存獨(dú)立的預(yù)后因子(HR=1.012 369 230, 95%CI:1.000 351 911-1.024 530 914，p=0.044)(見表3)、(見圖3)，即HNRNPC在肺腺癌中可能作為獨(dú)立危險(xiǎn)預(yù)后因子。

圖3 Multivariate分析模型(森林圖)Fig.3 Multivariate analysis model (Forest map)

表3 使用Cox回歸的TCGA患者與總體存活和臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)及變量選擇后的多因素生存模型(HNRNPC)Table 3 Association of TCGA patients with overall survival and clinicopathological features using Cox regression(HNRNPC) and multivariate survival model after variable selection (HNRNPC)

2.4 HNRNPC的表達(dá)和肺腺癌患者臨床病理學(xué)的關(guān)系

HNRNPC的表達(dá)與性別(p=0.02)、臨床分期(p=0.026)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(p=0.014)和組織浸潤(rùn)深度(p=0.001)顯著相關(guān)(見圖4)。使用logistic回歸分析顯示HNRNPC在肺腺癌中的表達(dá)與臨床分期(IV vs I,OR=3.692 308)和組織浸潤(rùn)深度(T2 vs T1,OR=1.776 471; T4 vs T1,OR=6.303 030)顯著相關(guān)(見表5,p<0.05)。這些結(jié)果表明在肺腺癌，HNRNPC的表達(dá)水平傾向于與臨床分期和組織浸潤(rùn)深度相關(guān)。

圖4 HNRNPC表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系(Kruskal(KS)檢驗(yàn))Fig.4 Relationship between HNRNPC expression and clinicopathological features(Kruskal (KS) test)

2.5 使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證

使用GSE68465進(jìn)行生存分析提示HNRNPC低表達(dá)組有更好的生存(p=0.009，見圖5a)。單因素Cox分析顯示HNRNPC的高表達(dá)與肺腺癌患者較低的總生存率相關(guān)，HR為1.367(95%CI：1.038-1.801，P=0.026)(見圖5b)。多因素Cox分析表明，HNRNPC表達(dá)水平是獨(dú)立的預(yù)后因素，HR為1.393(95%CI:1.060-1.831，p=0.017)(見圖5c)。通過驗(yàn)證后結(jié)果與之前TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)一致,兩次結(jié)果表明HNRNPC在肺腺癌中可能作為獨(dú)立危險(xiǎn)預(yù)后因子。

圖5 采用GEO進(jìn)行數(shù)據(jù)驗(yàn)證(GSE68465)Fig.5 Validation by GEO (GSE68465)

3 討 論

表觀遺傳學(xué)近年來已成為一個(gè)熱門話題，m6A甲基化修飾是100多種不同RNA修飾中最豐富的化學(xué)修飾。1974年m6A修飾最初是在poly(A)RNA部分中被鑒定，并且預(yù)測(cè)它可能在mRNA加工中起作用[24]。有證據(jù)表明RNA m6A修飾與腫瘤增殖、分化、腫瘤發(fā)生[25]、增殖[26]、侵襲[25]和轉(zhuǎn)移[27]有關(guān)。m6A修飾調(diào)節(jié)基因可能作為原癌基因或抑癌基因在腫瘤中發(fā)揮重要作用。

癌癥是一種復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳疾病，涉及癌基因和抑癌基因的突變和失調(diào)[28]。其中，表觀遺傳修飾可以通過抑制抑癌基因的表達(dá)和增強(qiáng)癌基因的表達(dá)來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[29]。近年來，肺癌領(lǐng)域m6A修飾的研究逐漸進(jìn)入研究者們的視野。Chao等[30]認(rèn)為m6A去甲基化酶ALKBH5通過下調(diào)FOXM1 mRNA的m6A修飾水平和促進(jìn)FOXM1的表達(dá)，影響間歇性缺氧條件下肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。同樣作為擦碼器，F(xiàn)TO通過降低肺鱗狀細(xì)胞癌中MZF1 mRNA轉(zhuǎn)錄物中的m6A甲基化水平和mRNA穩(wěn)定性來增強(qiáng)MZF1表達(dá)，從而起到腫瘤啟動(dòng)子的作用[31]。FTO可以通過上調(diào)USP7的表達(dá)來促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)[32]。對(duì)于相關(guān)閱讀蛋白的研究，已經(jīng)有研究結(jié)果表明，YTHDF2通過促進(jìn)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶mRNA的翻譯來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[33]。因此在肺癌中，m6A相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平有可能成為腫瘤分子診斷的潛在標(biāo)志物，也將為臨床上分子靶向治療的發(fā)展提供新的靶點(diǎn)。本研究是從生物信息學(xué)的角度發(fā)掘m6A甲基化因子在肺腺癌中的作用。

近期，Gao[34]等人從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中女性肺腺癌隊(duì)列進(jìn)行研究，該研究結(jié)果有助于評(píng)估女性肺腺癌患者的預(yù)后提供重要的理論支持。本研究首先評(píng)估了m6A調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)m6A調(diào)節(jié)因子在肺腺癌中差異表達(dá)。其中HNRNPC、YTHDF3、METTL3、YTHDF1、YTHDF2表達(dá)上調(diào)；WTAP、FTO、ZC3H13、METTL14下調(diào)。然后探索了這些分子之間的內(nèi)在聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)METTL14和YTHDC1是相關(guān)性最大的。也就是說，當(dāng)METTL14高表達(dá)時(shí)，YTHDC1很可能表達(dá)上調(diào)。隨后對(duì)這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行生存分析，Kaplan-Meier生存分析顯示僅僅HNRNPC和YTHDF2的表達(dá)與總體存活相關(guān)。然后，通過multivariate分析顯示HNRNPC可以成為肺腺癌總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。隨后，使用logistic regression回歸的單因素分析顯示HNRNPC在肺腺癌中的表達(dá)與臨床分期(IV vs I,OR=3.692 308)、組織浸潤(rùn)深度(T2 vs T1,OR=1.776 471；T4 vs T1,OR=6.303 03)(p<0.05)顯著相關(guān)。最后通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證,最后得出HNRNPC可能成為肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

在多種腫瘤或腫瘤細(xì)胞系中觀察到HNRNPC的異常上調(diào)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[35]，肝細(xì)胞癌[36]，黑素瘤[37]和肺癌[38]。作為RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)，HNRNPC參與RNA剪接[39-40]、非特異性RNA輸出[41]、RNA表達(dá)[35,42]、穩(wěn)定性[43-44]、3'末端加工[45]和翻譯[46]。敲除HNRNPC可以減少細(xì)胞增殖并增強(qiáng)依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這表明HNRNPC在GBM中起著致癌基因的作用[35]。同樣，HNRNPC過表達(dá)與胃癌細(xì)胞的化療耐藥密切相關(guān)，高表達(dá)水平的HNRNPC與臨床預(yù)后不良有關(guān)[47]。KHSRP和HNRNPC可通過激活I(lǐng)FN-α-JAK-STAT1信號(hào)通路誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[48]。最近，Huang[49]等人發(fā)現(xiàn)HNRNPC的過表達(dá)通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞的癌變。在我們的研究中，本研究發(fā)現(xiàn)HNRNPC在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。然后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HNRNPC的表達(dá)水平與肺腺癌患者的總生存期相關(guān)，且與臨床分期和組織浸潤(rùn)深度相關(guān)。最后發(fā)現(xiàn)HNRNPC可能作為獨(dú)立的預(yù)后因素，從而可能為肺腺癌提供新的治療靶點(diǎn)。

4 結(jié) 論

肺腺癌和正常對(duì)照之間發(fā)生的變化的RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)因子，可能在肺腺癌的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。HNRNPC表達(dá)可能是肺腺癌的潛在預(yù)后分子標(biāo)志物，但是需要更多的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。