葉若雷 蔡征遠 駱松梅

（麗水市中心醫(yī)院藥學部，麗水 323000）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是導致糖尿病患者心衰的首要危險因素[1]。DCM是獨立于冠心病以及高血壓以外，由于長期代謝障礙引起的心血管功能異常，且目前尚缺乏有效的防治方法[2]。研究顯示，DCM的病理生理學機制十分復雜，包括氧化應激損傷、炎癥反應、線粒體損傷及心肌細胞凋亡等在內的多種致病因素與DCM的發(fā)生及發(fā)展密切相關[3]。橙皮素（hesperetin，HSP）是一種在柑橘類果皮中發(fā)現的一種黃酮苷，具有抗炎、抗氧化及血管保護等生物活性[4-6]。體外細胞實驗證實，HSP能夠通過線粒體相關的抗凋亡途徑改善脂多糖誘導H9C2心肌細胞的凋亡[7]。但是由于HSP溶解度低、穩(wěn)定性差導致其在體應用生物利用度低，限制了其臨床應用[8]。納米粒是一種粒徑介于10～1 000 nm的新型藥物遞送載體[9]。應用納米粒包載難溶性藥物能夠顯著提高藥物溶解度、穩(wěn)定性及生物利用度[10]，有望解決難溶性藥物在體應用的藥動學缺陷。本研究擬制備包載HSP的新型納米粒，并將其在體應用探討HSP納米粒對預防糖尿病大鼠心肌病的效果及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康清潔級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠60只，體質量190～210 g，鼠齡約40～50 d，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SYXK（浙）2015-0001，質量合格證號：wydw2013-0050。飼養(yǎng)于SPF動物房：室內溫度22℃±2℃，濕度保持在45%～55%，12 h循環(huán)照明，自由攝食和飲水。

HSP批號YK0827B2812J，購自日本東京化成工業(yè)株式會社，純度≥99%；聚ε-己內酯（PCL，平均分子量8萬，深圳市光華偉業(yè)實業(yè)有限公司，批號10032003GT）；山梨醇單硬脂酸酯（Span-60，河南正通化工有限公司，批號20150210）；吐溫-80（湖南爾康制藥股份有限公司，批號20140501）；辛酸/酸/癸酸甘油三酯（北京鳳禮精求商貿有限公司，批號120411）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司，批號S0160）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（批號20160311），丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（批號20160501）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批 號20170319）均購自南京建成生物工程研究所；H-E染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20180525）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0013B）；BCA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20140722），兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2蛋白（Bcl-2，批號15071S）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3，批號19677S）及Bcl相關X蛋白（Bax，批號5023S）一抗均購自美國CST公司。

1.2 HSP納米粒的制備及其質量考察

參考Jornada等[11]橙皮素納米粒的制備方法制備載藥納米粒，方法簡述如下：將處方量聚ε-己內酯（PCL，0.1 g），山梨醇單硬脂酸酯（Span-60，0.038 g），辛酸/癸酸甘油三酯（0.165 mL）及HSP（0.005 g）加入到適量丙酮中水浴加熱40℃，磁力攪拌條件下充分溶解作為有機相。另取吐溫80（0.077 g）加入到50 mL雙蒸水中充分混勻作為水相。然后在40℃水浴及磁力攪拌條件下緩慢將上述有機相溶液注入到水相中形成HSP納米?；鞈乙?，室溫攪拌10 min，40℃減壓旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑即得包載HSP納米粒溶液。

應用透射電鏡觀察HSP納米粒的微觀形態(tài)。同時應用馬爾文激光粒度分析儀（Mastersizer 2000，英國）測定載藥納米粒的粒徑分布及Zeta電位。包封率的測定采用超速離心法，精密量取1.00 mL上述載藥納米粒溶液，7 280×g離心10 min后，取上清液稀釋后應用HPLC法（島津LC-20A型高效液相儀）測定上清液中HSP藥物含量。色譜柱：4.6×150 mm2。色譜條件：流動相，乙腈∶水∶0.1%乙酸體積比50∶49∶1，流速1.0 mL/min，檢測波長290 nm。

1.3 Ⅰ型糖尿病大鼠實驗模型建立及實驗分組

參考Zhang等[12]大鼠Ⅰ型糖尿病建模方法，采用腹腔注射STZ建立大鼠Ⅰ型糖尿病模型。隨機選取15只SD大鼠作為正常組，其余大鼠單次腹腔注射70 mg/kg STZ 建立Ⅰ型糖尿病模型，正常組大鼠給予等劑量PBS溶液。分別于STZ注射后第3、7、14天尾靜脈采血測定空腹血糖。大鼠空腹血糖值＞250 mg/dL，且明顯表現為多飲、多食及體質量減輕等癥狀即為Ⅰ型糖尿病模型建模成功。將實驗大鼠隨機分成正常對照組、糖尿病模型組（DM組）、HSP溶液組及HSP納米粒組，HSP溶液組及HSP納米粒組腹腔注射20 mg/kg HSP溶液或者HSP納米粒包括HSP 20 mg/kg，正常組及糖尿病模型組大鼠給予等劑量生理鹽水，所有治療形式每周干預2次，連續(xù)干預16周。

1.4 常規(guī)超聲檢查評價大鼠心功能

藥物干預結束后，應用常規(guī)超聲心動圖檢查大鼠心功能。將大鼠吸入式麻醉，仰臥位固定，褪去前胸毛發(fā)，行超聲心動圖測量各組大鼠左室收縮末期內徑（(left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、舒張早期與舒張晚期最大運動速度比值（ratio of early and late diastolic tissue peak velocity of mitral annulus，Em/Am）及左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。每只大鼠至少觀察3個連續(xù)的心動周期，計算其平均值。

1.5 H-E染色觀察心肌組織病理形態(tài)變化

超聲心功能檢查后處死大鼠，取左心室心肌組織，10%福爾馬林溶液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，片厚4 μm，H-E染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學變化。

1.6 心肌組織SOD、MDA及GSH-px水平測定

另取部分心肌組織，用生理鹽水洗凈后制成10%心肌組織勻漿液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定心肌組織SOD、MDA及GSH-Px含量，評價各組大鼠的氧化應激水平。

1.7 免疫印跡檢測心肌組織Bcl-2、caspase-3及Bax蛋白表達

將大鼠心肌組織剪碎后研磨，RIPA裂解緩沖液提取左心室組織蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度后，加緩沖液煮沸使蛋白變性，隨后進行SDSPAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，室溫封閉2～3 h。加入兔抗大鼠caspase-3、Bcl-2、Bax一抗（1：1 000）稀釋液，4℃搖床孵育過夜。洗液沖洗3次，每次10 min，再用辣根過氧化酶結合的二抗室溫孵育2 h，滴加發(fā)光液曝光。β-actin為內參。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數據以±s表示，兩兩比較采用方差齊性檢驗、t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩組間均數比較采用LSD-t法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HSP納米粒的質量表征

透射電鏡結果顯示HSP納米粒的微觀形態(tài)呈橢球形（圖1A），分散均勻，粒徑在150 nm左右。載藥納米粒的粒徑分布均勻（圖1B），平均粒徑為（161.34±9.71）nm。HSP納米粒的Zeta電位值為（-14.5±0.9）mV。載藥納米粒包封率為（91.23±5.23）%。

圖1 橙皮素納米粒透射電鏡下形態(tài)（A）及粒徑分布（B），標尺=200 nm

2.2 各組大鼠心功能比較

與正常對照組比較，DM組大鼠LVESD、LVEDD值顯著升高，LVEF、E/A和LVFS值 顯著降低；和HSP溶液組比較，HSP納米粒組的LVESD、LVEDD值顯著降低，同時LVEF、E/A和LVFS值顯著升高，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠心功能指標比較（n=15，±s）

表1 各組大鼠心功能指標比較（n=15，±s）

*P＜0.05 vs正常對照組；△P＜0.05 vs DM組；#P＜0.05 vs HSP溶液組

組別 LVESD（mm） LVEDD（mm） LVEF（%） E/A LVFS（%）正常對照組 3.98±0.41 6.38±0.26 80.78±8.78 1.47±0.27 60.76±6.14 DM組 5.79±0.67 8.47±0.25* 63.12±6.93* 0.73±0.14* 43.28±6.41*HSP溶液組 4.86±0.28 7.73±0.42△ 71.13±3.12△ 1.01±0.23b 48.56±6.32△HSP納米粒組 4.12±0.24 7.14±0.50△# 76.86±4.51△# 1.32±0.11△# 53.34±3.71△#

2.3 各組大鼠心肌組織形態(tài)結構比較

正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊、致密，結構清晰，染色均勻，細胞外間質較少（圖2A）；與正常對照組相比，DM組大鼠心肌細胞間隙增大，有明顯的心肌纖維損傷和斷裂，心肌細胞排列紊亂（圖2B）。與DM組相比，HSP溶液組及HSP納米粒組大鼠心肌組織大體完整，細胞排列較規(guī)則，細胞間隙明顯減少，心肌組織損傷改善較明顯（圖2C）。尤其是HSP納米粒組，心肌細胞排列規(guī)則，心肌纖維結構清晰，心肌組織完整，接近正常對照組水平（圖2D）。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學比較，H-E染色，標尺=50 μm

2.4 各組大鼠心肌組織SOD、GSH-Px、MDA含量比較

與正常對照組比較，DM組大鼠心肌組織SOD、GSH-Px含量顯著下降，MDA含量顯著升高；與DM組比較，HSP溶液組及HSP納米粒組心肌組織SOD、GSH-Px含量顯著升高，MDA含量顯著下降；與HSP溶液組比較，HSP納米粒組SOD、GSH-Px含量顯著升高，MDA含量顯著下降，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠心肌組織SOD、MDA及GSH-Px含量比較（n=15，±s）

表2 各組大鼠心肌組織SOD、MDA及GSH-Px含量比較（n=15，±s）

*P＜0.05 vs正常對照組；△P＜0.05 vs DM組；#P＜0.05 vs HSP溶液組

組別 SOD（U/mg） MDA（mmol/mg） GSH-Px（U/L）正常對照組 85.92±12.22 3.18±0.24 57.34±7.63 DM組 47.78±12.64* 4.93±0.32* 40.25±8.93*HSP溶液組 69.74±11.23△ 3.79±0.13△ 52.57±6.13△HSP納米粒組 79.38±14.45△# 3.32±0.23△# 56.24±7.12△#

2.5 各組大鼠心肌組織caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達比較

與正常對照組比較，DM組大鼠心肌caspase-3及Bax蛋白表達顯著增加，Bcl-2蛋白表達顯著下降；與DM組比較，HSP溶液組及HSP納米粒組大鼠心肌組織caspase-3及Bax蛋白表達顯著下降，Bcl-2蛋白表達顯著增加；與HSP溶液組比較，HSP納米粒組大鼠心肌組織caspase-3及Bax蛋白表達顯著下降，同時Bcl-2蛋白表達顯著增加。以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠心肌組織caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達比較

3 討論

已有研究顯示，應用新型的藥物遞送系統(tǒng)如環(huán)糊精包合物[13]及納米粒[14]等包載難溶性藥物HSP有望解決藥物在體研究的藥代動力學缺陷，實現藥物的臨床應用研究。本研究應用注入法制備包載難溶性藥物HSP的納米粒溶液，制備的載藥納米粒不僅形態(tài)圓整、分散性好，且粒徑分散均勻，藥物的包封率更是高達（91.23±5.23）%，說明載藥納米?？梢詫崿F對HSP的高包封。研究顯示，載體表面的同種電荷產生的靜電排斥力是維持載體在水溶液中穩(wěn)定的關鍵因素[15]。本研究應用PCL制備載藥納米粒，而PCL表面帶有羧基，在水中電離，使得制備的載藥納米粒帶負電位，Zeta電位值（-14.5±0.9）mV，且具有一定的穩(wěn)定性。

據文獻報道，大鼠腹腔注射STZ建立Ⅰ型糖尿病模型16周以后，能明顯觀察到心臟收縮及舒張功能受損，與Ⅰ型糖尿病患者DCM的癥狀相似，目前多用此方法制備大鼠DCM模型[16-17]。與之前文獻報道的結果一致，本研究結果顯示，DM大鼠較正常對照組左心室心功能出現了明顯損傷，表現為左心室LVESD、LVEDD值顯著升高，而LVEF、E/A和LVFS值顯著降低，同時DM組大鼠心肌組織排列紊亂，心肌纖維斷裂，心肌細胞損傷明顯。經過不同形式HSP治療干預組大鼠的心功能及心肌細胞病理情況較DM組顯著改善，表現為LVESD、LVEDD值顯著下降，而LVEF、E/A和LVFS值顯著升高，心肌組織基本完整，心肌細胞損傷情況較DM組明顯改善。同時HSP納米粒組的大鼠心功能改善較HSP溶液組更加顯著，接近于正常對照組水平，說明應用納米粒包載HSP能夠有效增加HSP的在體治療生物利用度，從而增加HSP對Ⅰ型糖尿病引起的DCM的治療作用。

氧化應激損傷是引起DCM發(fā)生及發(fā)展的重要因素。DM大鼠長期處于高糖水平導致機體處于氧化應激狀態(tài)，體內自由基增多，損傷線粒體DNA，引起細胞凋亡級聯反應，最終激活促凋亡蛋白Bax，降低Bcl-2含量，上調細胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3表達，從而引起心肌細胞凋亡[18]。與之前研究報道相符，本研究糖尿病組大鼠16周之后心抗氧化酶SOD、GSH-Px含量及Bcl-2蛋白表達較正常組顯著下降，同時MDA含量、caspase-3及Bax蛋白表達顯著升高，說明DM組大鼠心出現了明顯的氧化應激損傷及誘導心肌細胞凋亡增加。應用不同形式HSP治療能夠顯著提高心肌抗氧化酶SOD、GSH-Px含量及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時減少脂質過氧化產物MDA含量及凋亡相關蛋白Bax、caspase-3表達，說明HSP可能通過抑制氧化應激反應引起的心肌細胞凋亡從而發(fā)揮防治DCM的作用。

綜上所述，應用納米粒包載HSP能夠有效提高HSP在體應用的生物利用度，從而增加藥物防治DCM的效果。HSP在體應用可能通過抑制氧化應激損傷引起的細胞凋亡，從而發(fā)揮改善DCM大鼠心功能的作用，有望成為防治DCM的新型治療藥物。