吳 喆 胡逸萌 曹 冶 劉依婷 李 靜 周薈慧 呂建國(guó)△ 孫燕玲#

（湖北科技學(xué)院，1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2 五官醫(yī)學(xué)院，3 臨床醫(yī)學(xué)院&附屬第二醫(yī)院，咸寧 437100）

腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療有重要影響[1]。近年來(lái)，人們認(rèn)識(shí)到惡性膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為和臨床特征與腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境也密切相關(guān)[2]，因此激活抗腫瘤免疫，改善惡性膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境，可作為治療惡性膠質(zhì)瘤的一個(gè)重要策略。分子靶向治療可激活抗腫瘤免疫，改善腫瘤微環(huán)境。巨噬細(xì)胞集落刺激因子1受體（macrophage colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R）與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，是分子靶向治療的熱點(diǎn)[3-4]。Pyonteck等[5]研究結(jié)果表明，CSF-1R抑制劑能夠有效減緩腫瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制與巨噬細(xì)胞免疫抑制相關(guān)表型有關(guān)。大量研究顯示，腫瘤微環(huán)境促使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）向M2型分化，存在于腫瘤組織中的TAMs 大部分表現(xiàn)出M2 型巨噬細(xì)胞的表型，且與腫瘤的治療和預(yù)后密切相關(guān)[6-7]。如果逆轉(zhuǎn)此過(guò)程，TAMs 可能通過(guò)極化為M1 型發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。這為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供了新的思路。因此，本研究通過(guò)研究CSF-1R抑制劑BLZ945對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的作用，探討巨噬細(xì)胞極化在腫瘤治療中的分子機(jī)制，為BLZ945的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，武漢），根據(jù)美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC）的培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng)。

30只雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，5～6周齡，體質(zhì)量（150±10） g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（No.42000600030398）；動(dòng)物自由飲食進(jìn)水，動(dòng)物房溫度設(shè)定為25℃±2℃，濕度為45%，晝夜交替各12 h。

1.2 主要試劑

BLZ945購(gòu)自美國(guó)ApexBio公司；phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA，50 ng/mL）、ionomycin（1 μg/mL）購(gòu)自美國(guó)Sigma公 司；Brefeldin A（1 μg/mL）、anti-CD11b（clone M1/0）、anti-F4/80（clone BM8）、anti-IL-1β （clone NJTEN3）和anti-IL-10（clone JES5-16E3）購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；RT-PCR Kit購(gòu)自日本TaKaRa公司；γ-干擾素（interferon，IFN-γ） Rat ELISA Kit購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Rat細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）ELISA Kit購(gòu)自美國(guó)Life Span Biosciences公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備

適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，將Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：惡性膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型組（模型組），采用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞構(gòu)建原位惡性膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型；BLZ945低劑量治療組（低劑量組），腫瘤接種7 d后，大鼠接受尾靜脈注射BLZ945，注射4次（4～5天1次），注射濃度為0.1 mg/kg，注射體積為10 μL/g；BLZ945高劑量治療組（高劑量組），注射濃度為1 mg/kg，模型構(gòu)建和給藥方法同低劑量組。

在無(wú)菌條件下，10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，將動(dòng)物固定于腦立體定位儀，頭頂部正中切口，暴露前囟；將10 μL微量注射器固定于腦立體定位儀，注射針頭對(duì)準(zhǔn)前囟點(diǎn)后調(diào)零。注射針尖從前囟往后移1.0 mm，從中線往右移1.0 mm，臺(tái)式牙鉆機(jī)鉆一個(gè)直徑為1.0 mm的小孔，微量注射器以1.0 mm/min的速度緩慢進(jìn)針，往下進(jìn)針6.0 mm后往后退1.0 mm，注射針尖到達(dá)右側(cè)紋狀體的注射坐標(biāo)。10 min內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞懸液5 μL（約5×105個(gè)），留針5 min，隨后按1.0 mm/min的速度緩慢拔針，無(wú)菌骨蠟封閉骨孔，醫(yī)用膠粘合切口。術(shù)后每天肌注青霉素，10萬(wàn)U/只，持續(xù)5 d。

1.4 腫瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物預(yù)后觀察

觀察和記錄動(dòng)物的生存時(shí)間。治療結(jié)束后斷頸法處死大鼠，開(kāi)顱取全腦，稱取腦組織重量；取矢狀軸、水平軸及垂直軸三維參照坐標(biāo)法分割腦組織塊，選擇限定于視交叉前l(fā) mm 平面至乳頭體后緣平面的腦組織塊，測(cè)量腫瘤最大直徑a 及最小直徑b（冠狀面），根據(jù)公式“腫瘤體積（V） = 1/3×（a2×b）×π”計(jì)算腫瘤體積，其中a和b以mm測(cè)量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞免疫表型

從腫瘤組織中分離腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating leukocytes，TIL），用Brefeldin A、phorbol 12-myristate 13-acetate和ionomycin重新刺激從腫瘤組織分離的TIL，4～6 h后，先用CD11b和F4/80抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記，染色后用Fix/Perm溶液處理細(xì)胞，同時(shí)用IL-1β或IL-10抗體再次標(biāo)記細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行染色。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)IFN-γ和SOCS3 mRNA表達(dá)水平

提取大鼠腫瘤組織RNA并計(jì)算RNA濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)GenBank中 大 鼠GAPDH、IFN-γ和SOCS3全序列，取其保守區(qū)，按照逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，引物序列由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR引物序列如下：IFN-γ上游引物序列為5′-TGTTACT GCCAAGGCACACT-3′，下游引物序列為5′-TCTG TGGGTTGTTCACCTCG-3′；SOCS3上游引物序列為5′-TCTTTACCACCGACGGAA CC-3′，下游引物序列為5′-GCTAACTGGGAGCTACCGAC-3′；GAPDH上游序列為5′-GCATCTTCTTGTGCAGT GCC-3′，下游序列為5′-CTCGTGGTTCACACCC ATCA-3′。以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，按照RTPCR Kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)。凝膠成像儀成像，并照相記錄結(jié)果。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)IFN-γ和SOCS3蛋白表達(dá)水平

將一部分腫瘤組織（1 cm3）在液氮中冷凍20 min，然后在室溫下解凍20 min，凍融循環(huán)重復(fù)2次；隨后用玻璃勻漿器研磨腫瘤組織，并以2 200 r/min離心10 min以除去細(xì)胞碎片，并通過(guò)0.2 μm過(guò)濾器收集上清液。用Rat ELISA Kit檢測(cè)IFN-γ和SOCS3的表達(dá)，嚴(yán)格按照 ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，大鼠生存率采用Log-rank檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BLZ945對(duì)體內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用

與模型組比較，高劑量組和低劑量組腦重顯著減輕，腫瘤體積明顯變?。≒＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；與低劑量組比較，高劑量組的腦組織重量和腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 BLZ945對(duì)體內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用

2.2 BLZ945對(duì)荷瘤鼠生存率的影響

與模型組比較，高劑量組和低劑量組大鼠生存率顯著提高，且高劑量組與低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（圖2）。

圖2 BLZ945對(duì)荷瘤鼠生存率的影響

2.3 腫瘤組織中巨噬細(xì)胞免疫表型的變化

與模型組比較，高劑量組和低劑量組腫瘤組織中CD11b+F4/80+IL-10+巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著降低，CD11b+F4/80+IL-1β+細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且高劑量組與低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（圖3）。

圖3 3組腫瘤組織中巨噬細(xì)胞免疫表型的變化

2.4 腫瘤組織中IFN-γ和SOCS3的表達(dá)水平比較

與模型組比較，高劑量組和低劑量腫瘤組織IFN-γ表達(dá)明顯上調(diào)，SOCS3的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01，P＜0.001）；且高劑量組與低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 3組腫瘤組織中IFN-γ和SOCS3的表達(dá)水平

3 討論

膠質(zhì)瘤是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅲ、Ⅳ級(jí)惡性程度高、患者預(yù)后差，又稱惡性膠質(zhì)瘤[9]。近30年來(lái)，原發(fā)性惡性腦腫瘤發(fā)生率逐年遞增，年增長(zhǎng)率約為1.2%。隨著人們對(duì)惡性膠質(zhì)瘤認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為和臨床特點(diǎn)不僅取決于腫瘤細(xì)胞自身特性，與腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境也密切相關(guān)[2]。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互關(guān)系對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著重要作用，并最終影響療效和預(yù)后[1]。針對(duì)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的特異性分子進(jìn)行靶向治療是目前膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)。

CSF-1R由c-fms原癌基因編碼。大量基礎(chǔ)及臨床研究表明，c-fms基因重復(fù)復(fù)制、突變、染色體易位以及 CSF-1的過(guò)量表達(dá)等因素均能異常激活CSF-1R及其介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)途徑，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞異常增殖或相關(guān)炎癥因子的大量表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能紊亂及惡性腫瘤的發(fā)生[3-4]。CSF-1R抑制劑的開(kāi)發(fā)已進(jìn)入快速發(fā)展階段[10]，已有報(bào)道證實(shí)CSF-1R抑制劑在多種類型的腫瘤如卵巢癌、輸卵管癌、腹膜癌、多發(fā)性骨髓瘤和三陰乳腺癌中有效[11]。本研究通過(guò)腦立體定位儀定向操作成功構(gòu)建原位惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，采用CSF-1R抑制劑BLZ945經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)行治療，結(jié)果顯示BLZ945高劑量治療組生存率顯著提高，腦重顯著降低，顱內(nèi)腫瘤體積明顯減小，表明BLZ945能有效抑制惡性膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，并顯著提高荷瘤鼠的生存率。

腫瘤細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，作用于周圍的免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌[瘤表型，協(xié)助腫瘤免疫逃逸及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致免疫抑制[12]。TAMs來(lái)源于未成熟的單核細(xì)胞，被大量腫瘤源性細(xì)胞因子如CSF-1、IL-6、IL-10以及一系列化學(xué)趨化因子等募集到腫瘤區(qū)域。TAMs 在腫瘤微環(huán)境的誘導(dǎo)下發(fā)生表型和功能的轉(zhuǎn)換，并再產(chǎn)生趨化因子、生長(zhǎng)因子、血管生成因子和基質(zhì)蛋白酶等化學(xué)因子作用于腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移[13-14]。Cao等[15]研究顯示M2 型巨噬細(xì)胞增加腫瘤惡性程度，并最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的聚集和生長(zhǎng)。如果逆轉(zhuǎn)這個(gè)過(guò)程，TAMs 可能通過(guò)重新極化為M1 型而發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。本研究結(jié)果顯示，BLZ945降低了腫瘤組織中CD11b+F4/80+IL-10+巨噬細(xì)胞的數(shù)量，增加了CD11b+F4/80+IL-1β+細(xì)胞的數(shù)量，前者由于IL-10的產(chǎn)生更傾向于是抑制性亞群，后者由于IL-1β的產(chǎn)生更傾向于是炎癥性亞群，表明BLZ945可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞向M1型極化。

巨噬細(xì)胞的極化是一個(gè)多因子相互作用的復(fù)雜過(guò)程，細(xì)胞因子通過(guò)與巨噬細(xì)胞膜表面的特異性受體結(jié)合，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Duluc等[16]研究顯示，IFN-γ 能將人卵巢癌的TAMs轉(zhuǎn)化為M1型，從而激活抗腫瘤免疫。Qin等[17]將從髓系細(xì)胞敲除了SOCS3基因的LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠中提取的巨噬細(xì)胞與SOCS3fl/fl小鼠相比，M1型標(biāo)志物表達(dá)顯著上升。本研究結(jié)果顯示高劑量組腫瘤組織中SOCS3的表達(dá)下調(diào)，IFN-γ的表達(dá)上調(diào)，提示BLZ945通過(guò)調(diào)節(jié)IFN-γ和SOCS3的表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M2 型 向M1型極化。

腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞來(lái)源的微顆?？烧T導(dǎo)TAM向M2 型分化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和腫瘤干細(xì)胞的發(fā)展[18]。在此基礎(chǔ)上，本研究用大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在Wistar 大鼠上成功構(gòu)建原位惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究表明，CSF-1R 抑制劑BLZ945可明顯抑制惡性膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，并顯著提高荷瘤鼠的生存率，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果則表明BLZ945可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞向M1型極化，而通過(guò)RT-PCR和ELISA結(jié)果分析表明BLZ945可上調(diào)腫瘤組織中IFN-γ的表達(dá)，并下調(diào)SOCS3的表達(dá)。

綜上所述，CSF-1R抑制劑BLZ945通過(guò)調(diào)節(jié)IFN-γ和SOCS3的表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M2 型 向M1 型極化，激活抗腫瘤免疫，進(jìn)而抑制惡性膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，為惡性膠質(zhì)瘤生物治療提供新的路徑，并為惡性膠質(zhì)瘤免疫治療提供新的靶點(diǎn)。