曹智，王艷君，鄒文桐，丁可武，王昌偉，林智敏

(1.福建技術(shù)師范學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，福建 福清 350300; 2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

花是植物最為重要的生殖器官，從外向內(nèi)由花萼、花瓣、雄蕊和心皮組成．ABC模型闡明了花的進(jìn)化，B類和C類同源基因都存在于裸子植物中，C類基因在雄性和雌性生殖結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)，B類基因在雄性生殖組織中均有表達(dá)[1]．隨著Sepallata功能與E功能的研究，出現(xiàn)了新的修正模式“ABCDE”模式[2]．其中除了AP2之外，其他基因均為MADS盒基因． MADS-box是指一類編碼具有相同的DNA結(jié)合域和識別相似靶標(biāo)DNA序列[3]， 其蛋白通常是一個(gè)包含保守的60個(gè)氨基酸MADS-box基序(由MADS-box域，中間域I，K盒和C-末端結(jié)構(gòu)域四部分組成)的轉(zhuǎn)錄因子家族[4]．MADS盒蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，通常被歸類為I類和II類[5]．在開花植物中，MADS-box基因具有廣泛的功能，包括參與開花形成、開花時(shí)間的控制和營養(yǎng)生長的控制．MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在植物中相當(dāng)豐富，到目前為止，主要集中在雙子葉植物研究上[6].擬南芥有兩個(gè)A類基因：AP1和AP2，其中只有AP1編碼MADS盒轉(zhuǎn)錄因子[7]． 許多單子葉植物具有較高的社會和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，比如水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、百合(Liliumbrowniivar．viridulum)和蘭花(Oncidium Gower Ramsey)等花卉[4]．蝴蝶蘭花大、艷麗，而且花型豐富，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與觀賞價(jià)值，其形態(tài)上高度進(jìn)化，含有瓣化的花萼、特化的唇瓣和蕊柱．因此，代表了單子葉植物中具有明顯花被結(jié)構(gòu)的類型．選擇不同蝴蝶蘭材料對MADS-Box基因及其功能進(jìn)行研究，可為進(jìn)一步揭示單子葉植物高等類群花器官發(fā)育及開花調(diào)控奠定基礎(chǔ)[8]．目前，蝴蝶蘭基因組中已鑒定出51個(gè)MADS-box功能基因以及9個(gè)假基因，所有MADS-box聚類分析表明分為TypeI 和TypeII兩型．該研究表明MADS-box在蝴蝶蘭花朵中的表達(dá)模式和蛋白結(jié)構(gòu)域上存在差異，這些差異可能與蝴蝶蘭花朵特異的形態(tài)特征有關(guān)[9]．

本研究重點(diǎn)分析來源于蝴蝶蘭TypeII型不同類的10個(gè)基因：TypeII-E(MADS1/MADS7/AGL9)、TypeII-AGL6(MADS6)、TypeII-C/D (MADS3)、TypeII-B-AP3(AP3-like)、TypeII-B-PI(MADS2/MADS4/PI-like)和CMB1-like，比較這些蝴蝶蘭ABC MADS-box基在不同花色品種蝴蝶蘭花藥的表達(dá)模式，以及從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化上進(jìn)一步闡明MADS-box基因在蝴蝶蘭不同花結(jié)構(gòu)中的功能作用．

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蝴蝶蘭11個(gè)品種，包括：矩寶天使(A)、大辣椒(B)、黃金甲(C)、副樂西洋(D)、火鳳凰(E)、楓葉(F)、小桔子(G)、V3(H)、993(I)、光芒(J)和昌新皇后(K)，取樣于蝴蝶蘭智能溫室．

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取 用Trizol試劑提取取11個(gè)蝴蝶蘭品種盛花期的花藥總RNA，包括黃金甲品種的莖、葉、花藥、花瓣和萼片不同組織器官的總RNA．用液氮速凍，放-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 qRT-PCR分析MADS-box相關(guān)基因表達(dá) 用紫外可見分光光度計(jì)Nanodrop ND1000測定OD260/OD280，定量RNA濃度和純度，取1 g RNA為模板，以O(shè)ligo為引物合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄 (參見Fermenta反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書)．同樣定量測定反轉(zhuǎn)后的cDNA，每份樣品稀釋定量為100 ng/μL備用．

MADS家族選取10個(gè)基因，從NCBI上搜索其參考mRNA序列：MADS1 mRNA(AF234617．1)，MADS2 mRNA(AY378149．1)，MADS3 mRNA(AY378150．1)，MADS4 mRNA(AY378147．1)，MADS6 mRNA(AY678299)，MADS7 mRNA(JN983500．1)，AGL9 mRNA(XM_020716258．1)，CMB1-like mRNA(XM_020735419．1)，PI-like mRNA(AY771992．1)，AP3-like mRNA(AY771993．1)．用primer5．0設(shè)計(jì)引物，送上海捷瑞生物有限公司合成．反應(yīng)程序20 μL體系：SYBR Premix Ex TaqTM(Takara code:DRR041A) 10 μL，前引物和后引物各1 μL，cDNA 1 μL (濃度100 ng/μL)，ddH2O為8 μL．反應(yīng)體系：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)．每個(gè)樣品設(shè)立3次重復(fù)．Real-time qPCR擴(kuò)增和分析在ABI-7500定量PCR儀進(jìn)行，采用96孔反應(yīng)模塊，以Actin作為內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對定量，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量．

表1 熒光定量PCR所用引物

1.2.3 基因克隆、測序 以黃金甲品種(C)的花藥cDNA為模板，參考MADS3的全長cDNA序列設(shè)計(jì)編碼區(qū)兩端特異性引物進(jìn)行同源擴(kuò)增，以primer5．0設(shè)計(jì)克隆引物：D3F:5′-ATGGGGAGGGGGAAGATCGAGATA-3′；D3R:5′-TCAGGCGAGACGTAGATCATGAGG-3′．目的片段的全長為669 bp．PCR擴(kuò)增體系為50 μL體系：10×PCR buffer 12．5 μL， 10 mol/L dNTPs 2．5 μL， primer1和primer2各2 μL， KOD DNA聚合酶 1 μL， DNA 50 ng， 不足補(bǔ)水至50 μL．PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 3 min,98 ℃ 15 s， 58．5 ℃ 30 s， 68 ℃ 45 s， 35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min， 4 ℃保存．用北京天根DNA回收試劑盒回收目的片段，連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)涂板、挑菌和菌液PCR驗(yàn)證后，將有插入目的片段大小的樣品送由上海捷瑞生物有限公司測序完成．通過ClustalX軟件進(jìn)行該基因的蛋白結(jié)構(gòu)域和同源性分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭不同花色品種花藥中MADS-box基因表達(dá)

11個(gè)不同花色品種中不同的6個(gè)MADS-box基因的相對表達(dá)量水平見圖1.從圖中可以看出，不同的MADS-box基因在不同花色品種的表達(dá)水平存在明顯差異．定量分析表明，MADS1、MADS2、MADS3、MADS4和MADS7基因在黃金甲品種(C)中表達(dá)最高，而且這種高表達(dá)在MADS3和MADS4中與其他品種差異最為明顯．但是，MADS6在黃金甲品種(C)中的表達(dá)表現(xiàn)并不凸顯，相反其在993品種(I)中的表達(dá)最高．

圖1 MADS-box家族基因在11個(gè)不同蝴蝶蘭花色品種中的表達(dá)Fig.1 Expression in 11 different Phalaenopsis floral color varieties of MADS-box family genes

2.2 蝴蝶蘭不同花色品種花藥中MADS-like基因表達(dá)

11個(gè)不同花色品種中不同的3個(gè)MADS-like基因的相對表達(dá)量水平見圖2.其中3個(gè)不同基因的表達(dá)模式存在明顯差異．AGL9-like基因(圖2(a))與MADS-box家族基因一樣在黃金甲品種(C)中表達(dá)量最高；AP3-like(圖2(b))在花色品種F中表達(dá)量明顯比其他10個(gè)品種都高；PI-like(圖2(c))在11個(gè)花色品種中的表達(dá)沒有明顯的差異．

圖2 MADS-like基因在11個(gè)不同蝴蝶蘭花色品種中的表達(dá)Fig.2 Expression in 11 different Phalaenopsis floral color varieties of three MADS-like genes

2.3 兩個(gè)MADS-box基因的組織特異性表達(dá)分析

基于上述10個(gè)基因在11個(gè)花色品種中的不同表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)MADS3與MADSAP3-like兩個(gè)基因分別在黃金甲品種(C)和火鳳凰品種(F)中的影響較其他品種明顯(見圖1(c),圖2(b)).為了揭示MADS-box基因與蝴蝶蘭生長發(fā)育的關(guān)系，我們利用熒光定量qPCR檢測不同發(fā)育部位的莖、葉、花藥、花瓣和萼片的MADS3和MADSAP3-like基因的mRNA表達(dá)水平，如圖3所示.MADS3和MADSAP3-like在不同時(shí)期的表達(dá)具有相對的器官特異性．兩個(gè)基因都體現(xiàn)出在莖、葉中表達(dá)水平低下；而在花朵部分，即花藥、花瓣和萼片中均有表達(dá)，且在萼片中表達(dá)最高．但MADS3相對于MADSAP3-like而言，其在花藥部位表達(dá)相對較高(圖3)．

圖3 MADS3基因在花色品種C中不同組織器官中的表達(dá)Fig.3 MADS3 gene expression in different tissues and organs of C variety

圖4 MADS3基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of MADS3 gene

2.4 MADS3基因同源克隆分析

MADS3基因在黃金甲品種(C)中不同組織器官中的表達(dá)見圖3.從圖中可以看出，MADS3在花藥中的表達(dá)量與MADSAP-like相比，表達(dá)水平更高，因此我們以黃金甲(C)樣品cDNA為模板，利用MADS3(AY378150．1)mRNA基因序列的保守性設(shè)計(jì)引物，對其進(jìn)行特異性片段同源擴(kuò)增，克隆出的MADS3基因ORF全長為669 bp，編碼223個(gè)氨基酸(圖3)．TA克隆、驗(yàn)證，并送測序比較其cDNA序列和氨基酸序列的差異．用ClustalX軟件對氨基酸序列及DNA序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了3個(gè)堿基的改變：A 變?yōu)镚 (298 site)， G變?yōu)锳 (329 site)，C變?yōu)門 (624 site)；但氨基酸只是由于298堿基處發(fā)生了一個(gè)突變：由天冬酰胺(N)變成絲氨酸 (S)(圖5)．

圖5 MADS3氨基酸序列在樣品C花藥中與NCBI中MADS3基因的氨基酸序列的同源性比對Fig.5 Alignment of the deduced amino acid sequences of MADS3 in C anther and MADS3 gene in NCBI 注* :MADS3 in NCBI was marked as blod．

3 討論

MADS-box ABCDE基因是植物花發(fā)育的關(guān)鍵基因，此類基因通常編輯的是轉(zhuǎn)錄因子，它們在植物的生長發(fā)育過程中它們發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[10]．MADS-box基因的潛力來改善作物的多種繁殖性狀提供了一個(gè)極好的起點(diǎn)[11]．目前，大量的MADS-box基因已從不同植物中分離出來.以模式分物為例，擬南芥分離了132個(gè)MADS-box基因，具有功能的有107個(gè)；水稻分離了97個(gè)MADS-box基因，具有功能的有80個(gè)[12-13]． 當(dāng)前MADS-box的研究主要是通過花器官中的功能重要性分析，也有研究表明它們的突變表型和基因表達(dá)模式在植物其他器官中可能也是重要的[3]．通常MADS-box進(jìn)化形成的機(jī)制主要有兩種理論，第一種是常見的機(jī)制，是指通過改變關(guān)鍵上游調(diào)控基因的順式作用元件控制區(qū)來改變其表達(dá)模式而發(fā)生的；第二種機(jī)制是指涉及編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因復(fù)制，具有編碼和調(diào)控區(qū)域多樣性[14]， 比如在二倍體基因組植物擬南芥、水稻中可能是通過復(fù)制產(chǎn)生的[15]．雖然Type I型基因比Type II基因看起來有更快的進(jìn)化效率，但是數(shù)據(jù)表明，TypeII型MADS-box的大多數(shù)基因是控制花發(fā)育，與整個(gè)基因組復(fù)制事件是相關(guān)聯(lián)的[16]；而Type I型MADS-box卻更多地歸于小規(guī)模復(fù)制事件[17]．

在植物中，TypeII型MADS-box基因又稱為MIKC-type基因，所有這類基因中都含有4個(gè)不同結(jié)構(gòu)域[18]．它主要包括A-class類基因，B-class類基因(含API-like類基因和PI-like類基因)，C-class和D-class類基因和E-class類基因．A-class基因，如擬南芥中的AP1和SQUA，主要是負(fù)責(zé)從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變作用[19]．B類基因決定擬南芥的花瓣和雄蕊的特征[18]， 其中最為主要的是AP3-like蛋白和PI-like蛋白．C-class類基因主要與植物生殖器官相關(guān)，參與A-class類基因負(fù)調(diào)控[20]，主要的基因包括在雄蕊原基中強(qiáng)表達(dá)的OsMADS3基因和在花分生組織中表達(dá)水平低下的OsMADS58基因都屬于這一類[21]．E類基因主要是與A、B、C類蛋白形成復(fù)合物[22]，比如OMADS7和OMADS1屬于這一類[23-24]．在單子葉植物中，大多數(shù)這類基因研究已在水稻、小麥和玉米中進(jìn)行，而且具有一個(gè)相類似的開花模式，但是對于花卉作物，比如蘭花和百合花，其開花模式不同的．因此，開展蝴蝶蘭MADS-box類基因的研究對于揭示其開花模式顯得尤為重要．

本研究選了10個(gè)MADS-box基因做為研究對象，基本涵蓋了大部分開花模式基因．從結(jié)果上看，每個(gè)MADS基因在11個(gè)不同花色品種蝴蝶蘭中花藥中表達(dá)模式存在不同程度的表達(dá)水平，相互間差異明顯．但每個(gè)基因在黃金甲品種(C)中的表達(dá)量相比其他品種平均水平都高出很多，尤其是MADS3基因在黃金甲品種(C)中的表達(dá)相比其他品種明顯高出好多倍．過去的研究表明在蘭花中，OMADS3失去了MADS-box蛋白的C端基序，所以在營養(yǎng)葉中具有表達(dá)信號[25-26]，這點(diǎn)在本研究中也可以看到MADS3在莖中同樣檢測到表達(dá)．通過同源克隆的方法，我們成功克隆獲得蝴蝶蘭花色品種C的MADS3基因．通過氨基酸序列比較分析，發(fā)現(xiàn)與已經(jīng)公布在NCBI上(AY378150．1)序列在DNA水平上發(fā)生了3個(gè)堿基的改變，而在蛋白質(zhì)水平上發(fā)生了一個(gè)氨基酸的突變，由天冬酰胺(N)變成絲氨酸(S)．因此，我們推測MADS3在11個(gè)不同花色中的高表達(dá)水平可能與其氨基酸的改變有關(guān)．當(dāng)然MADSAP3-like在楓葉品種(F)中的表達(dá)水平也比其他品種高出好幾倍，但是由于其在花藥中的表達(dá)水平不高，所以本文不做進(jìn)一步的克隆研究．總之，了解MADS-box基因的功能有助于對不同花色結(jié)構(gòu)的起源提供信息，并為將來可能的作物改良提供研究基礎(chǔ)．