張婉麗，趙雅慧，吉慧敏，王東勝

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031）

蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench），又稱烏麥、三角麥，為蓼科蕎麥屬草本植物。蕎麥原產(chǎn)于中國，主要分布在北方以及西南地區(qū)，如陜西、內(nèi)蒙古、云南、四川。蕎麥富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)等，對許多疾病有一定的預(yù)防效果，是一種兼?zhèn)涫秤门c藥用的優(yōu)良作物。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們保健意識的增強，包括蕎麥在內(nèi)的一些小雜糧需求量不斷增大。雖然我國蕎麥種植面積居世界前列，但單位面積產(chǎn)量（850 kg/hm2）相較其他國家卻很低［1-3］。已有學(xué)者通過育種技術(shù)［4］以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)［5］對提高蕎麥產(chǎn)量進行研究，但從根際微生物方面改善蕎麥生長條件卻鮮有報道。

根際概念最早于1904年由德國科學(xué)家Lorenz Hiltner提出，指緊貼于根系的薄層土壤，該處土壤由于受到根系生長代謝的影響，表現(xiàn)出與周圍土體不同的理化性質(zhì)。生長在根際土壤中的微生物稱為根際微生物［6］。根際是植物與土壤進行交互作用的關(guān)鍵點，根際微生物在植物生長和土壤養(yǎng)分循環(huán)中的作用已成為近年來微生物的研究熱點［7-9］。大量研究表明，植物-根際微生物互作對植物健康生長起著重要作用，根系通過富集周圍土壤的特定菌群，造成根際微生物多樣性低于非根際土壤，但數(shù)量卻高于非根際土壤［10］。植 物 的 類 型［11］、生 育 時 期［12］、生 長 環(huán)境［13］均會對根際微生物的種類組成及生態(tài)分布產(chǎn)生影響。同時，根際微生物可以通過促生機制、生防機制來促進植物生長。如溶磷菌可以將環(huán)境中難溶無機磷轉(zhuǎn)換成植物可吸收形式促進種子萌發(fā)，增加干重［14］；鏈霉菌通過拮抗病原菌降低黃瓜立枯病發(fā)病率，提高種子發(fā)芽率，促進幼苗生長［15］；此外，根際微生物還可以影響氮的有效性，將色氨酸轉(zhuǎn)換為吲哚乙酸調(diào)控植物開花時間，以此進一步促進植物生長［16］。

目前我國許多地區(qū)存在過量及不平衡施肥等問題，一方面會污染環(huán)境，使得土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，土體質(zhì)量下降，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)受到影響，另一方面還會增加農(nóng)戶生產(chǎn)成本（化肥占生產(chǎn)總物資費用50%左右）［17］。根際益生菌是菌肥的主要菌種來源，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中有著巨大的應(yīng)用潛力。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，將有益微生物制作成菌肥來代替一部分化肥越來越成為可能。馬軍妮［18］用婁徹氏鏈霉菌和密旋鏈霉菌制成放線菌菌劑，可提高幼苗總鮮重、葉片凈光合速率和根系誘導(dǎo)酶活性，增強小麥抗逆性、穗粒重等。周冬梅［9］從擬南芥根際中篩選出兩株具有抗旱能力的菌株Burkholderia sp．ARD10和Mitsuaria sp．ARD17，均具有產(chǎn)生EPS和ACC脫氨酶的能力，經(jīng)過對玉米的促生試驗發(fā)現(xiàn)，在干旱條件下能顯著提高葉片含水量、脯氨酸積累量以及過氧化物酶（POD）活性，還可提高玉米在干旱脅迫中的激素含量，從而提高干旱耐受性。目前有關(guān)蕎麥根際微生物的報道很少，因此本試驗以蕎麥為研究對象，從其根際土壤篩選出具有抗菌活性、解磷活性及產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力的菌株，旨在篩選出具有促生功能的有益菌并開發(fā)成菌肥，從而促進蕎麥增產(chǎn)和綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

土樣來自晉蕎（苦）5號根際，蕎麥于2020年10月26日采自于山西省晉中市太谷縣侯城鄉(xiāng)孟家莊村（112．595583°E，37．439568°N，海拔769～830 m），密度90萬株/hm2。樣品于-80℃保存。

1．2 試驗方法

1．2．1 樣品預(yù)處理 輕輕抖落掉與蕎麥根系附著不緊密的土壤，將根與附著土壤一起稱重后，放入90 mL無菌水中洗凈撈出，擦干稱重，兩者重量之差即為根際土壤重量（0．5 g），根際土壤溶液記作10-2。將根際土壤溶液放入錐形瓶搖床振蕩30 min使其充分混勻，使用移液管吸取1mL轉(zhuǎn)入裝有9 mL無菌水試管中，記作10-3，依次稀釋為10-4、10-5。

1．2．2 根際微生物的分離純化 采用稀釋平板涂布法進行分離。細菌涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（BPA）［19］，放線菌涂布于高氏一號（GA）［19］、TWYE［20］、ISP2［21］培養(yǎng)基，稀釋梯度均選取10-3、10-4、10-5。真菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）［19］，稀釋梯度選取10-2、10-3、10-4。每個梯度3個重復(fù)，共45（5×3×3）個平板。置于28℃恒溫箱中，細菌培養(yǎng)2～3 d，真菌培養(yǎng)3～4 d，放線菌培養(yǎng)7～8 d。挑取形態(tài)、大小不同的菌株采用平板劃線法進行純化，重復(fù)2～3次，直至出現(xiàn)單菌落。編號后于斜面中保藏備用。

1．2．3 生物活性檢測

（1）菌株活化：將保藏真菌接種于PDA培養(yǎng)基中進行活化；細菌、放線菌分別涂布于BPA、GA培養(yǎng)基中進行活化，完成后用6 mm直徑打孔器打孔備用。

（2）抗菌活性檢測：供試病原菌均由山西師范大學(xué)微生物實驗室提供，分別為大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、青霉菌（Penicillium sp．）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。在接種靶標菌的試管中注入適量無菌水，輕輕抽提攪拌，制成懸菌液。使用移液管將病原細菌懸菌液滴至BPA培養(yǎng)基中，病原真菌滴至PDA培養(yǎng)基中，用涂布器均勻涂開。

放線菌和真菌采用瓊脂塊法［19］：28℃培養(yǎng)1～2 d，觀察是否產(chǎn)生透明圈，并記錄透明圈直徑。細菌采用對峙法［22］：28℃培養(yǎng)1 d，觀察十字交叉處靶標菌的生長情況。

（3）酶活性檢測：培養(yǎng)基為H1-1培養(yǎng)基［23］，放線菌和真菌采用瓊脂塊法，28℃培養(yǎng)2～3 d；細菌采用點接法［24］，37℃培養(yǎng)1～2 d。檢測蛋白酶活性時，可直接觀察透明圈；檢測淀粉酶活性時，滴加適量碘液后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈。

（4）解磷活性檢測：采用點接法，培養(yǎng)基為磷酸鈣固體培養(yǎng)基［25］，28℃培養(yǎng)3～4 d，觀察透明圈。

1．2．4 菌種鑒定 對所篩選廣譜活性菌株進行鑒定，由上海派森諾基因科技有限公司完成。將所測真菌序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST（https：//blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi）比對，所獲細菌、放線菌序列利用EzBioCloud（https：//www．ezbiocloud．net/）數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選相似度較高序列通過MEGA 10．2．5軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 蕎麥根際微生物的種類及數(shù)量

蕎麥根際土壤中富含大量微生物，共分離出72株菌，其中放線菌39株、真菌18株、細菌15株。從表1可看出根際微生物中細菌數(shù)量最多，約為6．2×108cfu/g，其次是放線菌，約為（3．7～7．1）×107cfu/g，真菌數(shù)量最少，約為3．7×105cfu/g。GA培養(yǎng)基分離得到的放線菌種類最多，占放線菌總數(shù)目的43．6%；ISP2培養(yǎng)基的分離種類最少。

表1 蕎麥根際土壤微生物數(shù)量

2．2 蕎麥根際微生物的抑菌活性

由表2可知，對酵母菌、青霉、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有拮抗活性的分別有23、5、3、25株。放線菌的拮抗活性較好，在拮抗各靶標菌總數(shù)中分別占82．6%、100．0%、66．7%、76．0%。透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值越大，透明度越高，證明其拮抗活性越好，其中4株放線菌SI16、SG15、SG22、ST1-1的抗菌活性較好，均具有3種抗菌活性（表3）。

表2 不同種類菌株拮抗活性篩選結(jié)果

表3 4株放線菌對4種靶標菌的拮抗能力

2．3 蕎麥根際微生物的酶活性

以可溶性淀粉、脫脂奶作為篩選底物，對72株菌進行功能酶活性篩選，其中有15株菌具有蛋白酶活性，占比20．8%；14株菌有淀粉酶活性，占比19．4%；同時具有兩種酶活性的有4株，占比5．6%。對具有蛋白酶活性的菌株測量其透明圈，D/d值越大，透明度越高，證明其活性越高。從表4中可看出SB1、SG13、SG15的蛋白酶活性較好，從表5中可看出SI21、SG2-2、SG15、ST1-1、ST1-2的淀粉酶活性較好。

表4 蕎麥根際微生物蛋白酶活性篩選結(jié)果

表5 蕎麥根際微生物淀粉酶活性篩選結(jié)果

2．4 蕎麥根際微生物的解磷活性

以Ca3（PO4）2作為難溶性磷酸源，篩選具有解磷活性的菌株，試驗共發(fā)現(xiàn)10株菌（細菌、真菌）具有解磷活性，占比13．9%。從表6中可看出，菌株SB16、SB3-2、SP5解磷效果較好。

表6 蕎麥根際微生物解磷活性篩選結(jié)果

2．5 廣譜活性菌株的鑒定

通過對72株菌進行生物活性檢測，發(fā)現(xiàn)SG15的活性最好，具有5種活性；有3株菌（SI16、SG9、ST1-1）具有4種活性，7株菌（SB2、SP1、SP12、SG2-2、SG16、SG22、ST1-2）具有3種活性，18株菌具有2種活性，20株菌具有1種活性，分別占比1．4%、4．2%、9．7%、25．0%、27．8%（圖1）。三種菌中，放線菌的生物活性最好，有活性菌株占總放線菌株的82．1%，占總活性菌株的65．3%，因此放線菌是一類重要的微生物資源。將具有3種及以上活性的菌株列為廣譜活性菌株，對細菌、真菌和活性最強的5株放線菌進行鑒定，結(jié)果（圖2）表明，放線菌均為鏈霉菌屬，SI16、ST1-1、SG9、SG15、SG22分別與Streptomyces acidiscabies（D63865）、Streptomyces parvus（AB184756）、Streptomyces canus（KQ948708）、Streptomyces coacervatus（AB500703）、Streptomyces paradoxus（AB184628）相似度為99．79%、99．86%、99．86%、98．51%、100．00%。細菌SB2為芽孢桿菌屬，與Bacillus inaquosorum（AMXN01000021）相似度為99．65%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示真菌SP1、SP12聚為一簇，均為鐮刀菌屬，但其形態(tài)明顯不同，所以可能為不同亞種，還需進一步研究（圖3）。

圖1 蕎麥根際72株菌的生物活性篩選結(jié)果

圖2 基于16S rRNA基因序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于ITS序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

自然界土壤中富含大量微生物，實驗室條件下的可培養(yǎng)微生物只占很小一部分，未來可通過共培養(yǎng)技術(shù)、改善生長條件等獲取更多的微生物資源。植物-有益微生物互作對雙方均是有利的，根系分泌物可為微生物提供營養(yǎng)來源，而微生物可通過拮抗病原菌、固氮、解磷、解鉀、產(chǎn)酶、產(chǎn)植物激素等幫助植物改善生長條件，獲取更多養(yǎng)分。不同植物種類、土壤環(huán)境、大氣條件都可對根際微生物產(chǎn)生影響［9，26］。將有益微生物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有利于改善生態(tài)環(huán)境及提高經(jīng)濟效益，因此開發(fā)未知微生物資源十分重要。

本研究發(fā)現(xiàn)放線菌與細菌、真菌相比，生物活性較好，有活性菌株占放線菌總數(shù)82．1%，可見放線菌是一類具有重要價值的微生物資源。GA、ISP2、TWYE三種培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量與種類有所不同，ISP2培養(yǎng)基分離數(shù)量最多，GA培養(yǎng)基分離的種類最多，因此改變培養(yǎng)基成分可能會對分離效果產(chǎn)生影響。王東勝等［27］向GA培養(yǎng)基添加CaCl2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些土樣放線菌數(shù)量顯著減少，但新種類有所增加。因此后期試驗可通過改變培養(yǎng)基成分獲取蕎麥根際更多的放線菌資源。

對于拮抗活性檢測，放線菌的抑菌效果最為顯著，有活性菌株占放線菌總數(shù)69．2%，占蕎麥根際總菌株37．5%，且篩選到4株菌同時具有3種拮抗活性。這可能與放線菌可產(chǎn)生大量抗生素有關(guān)，抗生素可通過干擾病原菌細胞壁合成、改變細胞內(nèi)部代謝等來拮抗病原菌。事實上，大部分抗生素都是由放線菌產(chǎn)生的，朱榮貴等［28］從塔里木盆地分離得到18株稀有放線菌，其中14株具有抗生素合成基因。放線菌對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）比對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的抑制力要強，這可能是因為革蘭氏陰性菌存在外排泵可降低細胞內(nèi)抗生素含量，從而降低其敏感性［29］?？莶菅挎邨U菌因其天然無害、性能優(yōu)良，已大量應(yīng)用于動物飼料中［30］。本試驗中芽孢桿菌SB2可拮抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，與已有報道一致［31］；另外菌株SB2還具有良好的解磷活性。微生物來源的蛋白酶與淀粉酶因其種類豐富、生長條件易控等特點在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用［32，33］。放線菌SG15的蛋白酶與淀粉酶活性均較好，具有較高的應(yīng)用潛力。具有解磷活性的菌株中，細菌占比最多（占總解磷菌株70．0%），真菌次之，未檢測到有放線菌具有解磷活性，與前人報道［34］相似，具體解磷機制尚不清楚。有研究顯示以磷酸鈣作為磷源，溶磷圈直徑大小并不能代表菌株真實解磷能力［35］，因此試驗還需進一步對解磷菌株在液體培養(yǎng)基中的解磷能力進行測定。

蕎麥根際存在豐富的微生物資源，本研究篩選到11株具有廣譜生物活性的微生物菌株，后續(xù)可用于開發(fā)功能菌肥。