張立蘋(píng)，華再東，肖紅衛(wèi)，任紅艷，朱 喆，畢延震

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064）

體外受精（In Vitro Fertilization，IVF）是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境下，通過(guò)人工手段完成受精過(guò)程的技術(shù)，此技術(shù)成功于20 世紀(jì)50 年代，在最近20 年發(fā)展迅速，現(xiàn)已日趨成熟并成為一項(xiàng)重要且常規(guī)的動(dòng)物繁殖生物技術(shù)。IVF 技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，同時(shí)成為研究動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)如體細(xì)胞重編程、胚胎干細(xì)胞及性別控制等的重要輔助手段。此外，利用IVF 技術(shù)檢測(cè)精子受精能力也成為可能。Yanagimachi利用無(wú)透明帶地鼠卵進(jìn)行人精子IVF，成功建立異種IVF 方法，即精子穿透無(wú)透明帶地鼠卵試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱(chēng)精子穿透試驗(yàn)，Sperm Penetration Assay，SPA），并證實(shí)了此方法可作為預(yù)測(cè)男性生育能力的有效模型。由于人卵母細(xì)胞比較難獲得，目前，SPA 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人精子受精能力和受精潛能驗(yàn)證試驗(yàn)中，并在臨床上被作為一種檢測(cè)生育能力的重要手段，同時(shí)，SPA 還被廣泛應(yīng)用于精子運(yùn)動(dòng)與受精的關(guān)系、精子獲能的生理機(jī)制等基礎(chǔ)研究中。

目前，主要以倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞為受體進(jìn)行異種動(dòng)物IVF 研究，但倉(cāng)鼠的成本較高、飼養(yǎng)條件更為苛刻。因此，本研究選擇成本較低、比較容易飼喂的昆明小鼠，獲取其卵母細(xì)胞為受體，對(duì)西門(mén)塔爾牛冷凍精子進(jìn)行IVF，旨在建立適用于本實(shí)驗(yàn)室的昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF體系，為研究雄原核的形成和受精卵的發(fā)育機(jī)理提供試驗(yàn)素材。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和精子來(lái)源 實(shí)驗(yàn)所用昆明小鼠購(gòu)買(mǎi)于武漢市疾控中心；實(shí)驗(yàn)所用精液為西門(mén)塔爾奶牛冷凍精液，購(gòu)買(mǎi)于武漢市奶牛改良站。

1.1.2 主要試劑與儀器 西門(mén)塔爾牛體外受精液BO 液配方：6.55 mg/mL 氯化鈉+0.3 mg/mL 氯化鉀+0.249 mg/mL氯化鈣+0.0497 mg/mL 氯化鎂+0.0869 mg/mL 磷酸二氫鈉+3.104 mg/mL 碳酸氫鈉+2.5 mg/mL 葡萄糖+0.055 mg/mL 丙酮酸鈉+0.065 mg/mL 青霉素+0.05 mg/mL硫酸鏈霉素。西門(mén)塔爾牛體外受精獲能液BO-A 液配方：BO 液+5 mmol/L 咖啡因+10 mg/mL 肝素鈉+3 mg/mL 牛血清白蛋白。奶牛胚胎培養(yǎng)液CRlaa 配方：114.7 mmol/L氯化鈉+3.1 mmol/L 氯化鉀+26.2 mmol/L 碳酸氫鈉 +0.4 mmol/L 丙酮酸鈉+5.0 mmol/L 乳酸半鈣+3 mg/mL牛血清白蛋白+1.0 mmol/L-谷氨酰胺。小鼠胚胎培養(yǎng)液M2、小鼠IVF 受精液HTF 購(gòu)買(mǎi)于Sigma 公司；超排激素人絨毛膜促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）購(gòu)買(mǎi)于寧波第二激素廠(chǎng)。Olympus IX70 倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獲取昆明小鼠成熟卵母細(xì)胞 選取6～10 周齡昆明雌鼠控光（14 h 光照，10 h 黑暗）飼養(yǎng)1～2 周后，按照 10 IU/只的劑量腹腔注射PMSG，注射 46～48 h 后，按照10 IU/只腹腔注射hCG 進(jìn)行超排。超排20～22 h 后，采用頸椎脫臼法處死超排小鼠，75%酒精消毒后切開(kāi)腹腔，剪下輸卵管及連接的一小段子宮，置于有杜氏磷酸緩沖鹽液（DPBS）的平皿中，體式顯微鏡下用帶針頭的一次性1 mL 注射器刺破輸卵管壺腹部，獲得超排卵母細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀(guān)察，獲得帶有第一極體的成熟卵母細(xì)胞。

1.2.2 西門(mén)塔爾牛優(yōu)質(zhì)精子獲取 采用上浮法獲取優(yōu)質(zhì)精子，具體操作方法：從液氮罐取凍精細(xì)管置37℃水浴中30～40 s 快速解凍，75%酒精消毒后剪開(kāi)細(xì)管，將精子移入含1 mL BO 的離心管中，用1 mL 量程移液槍輕輕吹打，上下顛倒幾次，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置20～30 min，使精子上浮，上浮后的精子600×g 離心5 min，棄上清，重復(fù)3 次，獲得所需優(yōu)質(zhì)精子。優(yōu)質(zhì)精子的選擇標(biāo)準(zhǔn)：倒置顯微鏡400×視野下觀(guān)察，形態(tài)正常、直線(xiàn)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子占比90% 以上可用于IVF，反之棄掉，重新準(zhǔn)備。

1.2.3 IVF 及受精卵的體外培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1：比較體外受精液對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響。實(shí)驗(yàn)分為2 個(gè)處理組，其中A 組將帶有第一極體的成熟昆明小鼠卵母細(xì)胞置于BO-A 液中平衡30 min，BO 液處理西門(mén)塔爾牛精液，IVF 微滴采用BO-A 液；B 組中，將成熟的昆明小鼠卵母細(xì)胞置于HTF 中平衡30 min，HTF 液處理西門(mén)塔爾牛精液，IVF 微滴采用HTF 液。體外受精用精子的工作濃度為3×10個(gè)/mL，采用西門(mén)塔爾牛IVF 條件進(jìn)行精卵孵育6 h（39℃，5% CO，飽和濕度）。IVF 6 h 后，用移液器輕輕吹打卵母細(xì)胞，除去浮在卵母細(xì)胞表面的精子，倒置顯微鏡下觀(guān)察雄原核形成情況。將觀(guān)察到帶有雄原核的卵母細(xì)胞用CRlaa 洗滌3 次后，置于CRlaa 中采用奶牛胚胎培養(yǎng)條件培養(yǎng)（39℃，5%CO，飽和濕度）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2：比較IVF 條件對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響。在實(shí)驗(yàn)1 結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1 IVF 相同的方法進(jìn)行IVF 實(shí)驗(yàn)，采用西門(mén)塔爾牛體外受精液（BO 液）和獲能液（BO-A 液），IVF 條件全部調(diào)整為昆明小鼠卵母細(xì)胞的培養(yǎng)條件，即37℃，5% CO，飽和濕度。并將觀(guān)察到雄原核的卵母細(xì)胞用M2 洗滌3 次后，置于M2 中采用小鼠胚胎培養(yǎng)條件培養(yǎng)（37℃，5% CO，飽和濕度）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3：對(duì)比透明帶對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響。在實(shí)驗(yàn)1 和實(shí)驗(yàn)2 基礎(chǔ)上，用0.25% 鏈霉蛋白酶去除昆明小鼠卵母細(xì)胞透明帶后，用西門(mén)塔爾牛體外受精液（BO 液）處理冷凍精子，并采用西門(mén)塔爾牛獲能液（BO-A 液）和培養(yǎng)條件（39℃，5% CO，飽和濕度），采用同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1 中IVF 相同的操作方法進(jìn)行IVF 實(shí)驗(yàn)，對(duì)比透明帶對(duì)雄原核形成的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)每重復(fù)1 次均為同一批次試驗(yàn)，使用相同來(lái)源的卵巢和試驗(yàn)條件，所有試驗(yàn)至少重復(fù)4 次。數(shù)據(jù)采用檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 受精液對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響 表1顯示，受精液和獲能液顯著影響異種動(dòng)物IVF 結(jié)果，采用西門(mén)塔爾牛精子受精液和獲能液，雄原核形成率高于采用昆明小鼠受精液組（<0.05），且卵裂率達(dá)26.09%。

表1 受精液對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響

2.2 受精條件對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響 表2 顯示，采用西門(mén)塔爾牛體外受精條件的雄原核形成率（12.34% vs 3.55%）和卵裂率均（26.32% vs 0%）高于小鼠胚胎培養(yǎng)條件（<0.05）。

表2 受精條件對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響

2.3 透明帶對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響 由表3中可知，用0.25% 鏈霉蛋白酶去除昆明小鼠卵母細(xì)胞透明帶后，更有利于西門(mén)塔爾牛精子附著并穿入卵內(nèi)，進(jìn)而形成雄原核，去除透明帶后雄原核形成率達(dá)高于有透明帶（<0.05），但是無(wú)透明帶組多個(gè)雄原核的比例高于有透明帶組（7.04% vs 4.07%），且無(wú)透明帶組卵裂率低于有透明帶組（<0.05），分析透明帶在精子入卵過(guò)程中起到識(shí)別和阻礙多個(gè)精子入卵的作用，無(wú)透明帶時(shí)更容易發(fā)生多精入卵形成2 個(gè)雄原核，而多精入卵直接影響了受精卵的卵裂率。

表3 透明帶對(duì)昆明小鼠-西門(mén)塔爾牛IVF 的影響

2.4 獲得的西門(mén)塔爾牛雄原核 由圖1 可知，以昆明小鼠體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞為受體進(jìn)行西門(mén)塔爾牛冷凍精液IVF，可以形成西門(mén)塔爾牛雄原核。

圖1 西門(mén)塔爾牛雄原核

3 討論

IVF 技術(shù)包括動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟、體外受精及胚胎的體外培養(yǎng)技術(shù)，學(xué)者利用該技術(shù)可以在體外環(huán)境中模擬體內(nèi)的生理過(guò)程，并以此為模型獲得了諸多關(guān)于動(dòng)物受精過(guò)程和機(jī)理的本質(zhì)性認(rèn)識(shí)。1962 年，Suzuki 等成功地在新鮮的輸卵管液中使兔卵母細(xì)胞體外受精，并且發(fā)育到4 細(xì)胞，這為哺乳動(dòng)物IVF 技術(shù)的建立和IVF 胚胎的生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，并且在瀕危動(dòng)物和優(yōu)良家畜品種的后代續(xù)繁、性別控制、品種資源保存等方面的應(yīng)用具有重大意義。哺乳動(dòng)物正常受精過(guò)程中，精子必須先穿過(guò)透明帶和卵質(zhì)膜才能進(jìn)入卵子，而透明帶和卵質(zhì)膜作為受精的一個(gè)屏障，理論上只允許同種類(lèi)的精子穿過(guò)，異種動(dòng)物的精子無(wú)法穿過(guò)，因此異種動(dòng)物卵母細(xì)胞胞質(zhì)能否支持IVF 和進(jìn)一步發(fā)育具有非常重要的理論和實(shí)際意義。

研究發(fā)現(xiàn)，地鼠卵母細(xì)胞去除透明帶后，其卵膜對(duì)人、小鼠、大鼠、兔、羊、牛等哺乳類(lèi)動(dòng)物精子都可接受，且異種體外受精率很高，人精子可達(dá)90%以上，由此在人類(lèi)醫(yī)學(xué)臨床上建立了精子穿透試驗(yàn)并作為預(yù)測(cè)男性生育能力的檢測(cè)手段，說(shuō)明異種動(dòng)物體外受精是可行的。Zhao 等將咖啡因處理過(guò)的牛精子和無(wú)透明帶或透明帶完整的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF，發(fā)現(xiàn)均能夠形成雄原核或精子頭部變大；Chatiza 等使用牛IVF 體系進(jìn)行跳羚、黑斑羚、南非白面大羚羊附睪尾精子的精-卵互作和功能研究，發(fā)現(xiàn)3 種羚羊的精子都可以穿透牛卵母細(xì)胞并形成雄原核，且能夠分裂到8-細(xì)胞階段；劉玉良分別用活的大熊貓精子、精子頭核和死精子注射到金黃地鼠卵中并進(jìn)行電激活，受精率分別為29.63%、19.3% 和18.97%，但其沒(méi)有觀(guān)察后續(xù)胚胎發(fā)育的結(jié)果，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差無(wú)幾，本實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠卵母細(xì)胞作為受體，進(jìn)行西門(mén)塔爾牛冷凍精子IVF，在西門(mén)塔爾牛冷凍精子的受精液和受精條件下，雄原核形成率為17.8%，卵裂率為27.27%，但是胚胎并未發(fā)育到桑椹胚階段，結(jié)果表明種屬相差較遠(yuǎn)的異種動(dòng)物可以進(jìn)行IVF 并形成雄原核與卵裂，但是其受精卵的后續(xù)發(fā)育比較困難，原因可能是IVF 涉及卵母細(xì)胞的體內(nèi)成熟、采集和體外成熟培養(yǎng)、精子獲能、體外受精、胚胎培養(yǎng)及胚胎移植等諸多環(huán)節(jié)中，構(gòu)成IVF 微環(huán)境的受精液和受精溫度在異種動(dòng)物IVF 中起到關(guān)鍵作用；然而，透明帶和卵質(zhì)膜在動(dòng)物受精過(guò)程中作為精子入卵的屏障，起到篩選和識(shí)別的作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)透明帶時(shí)，雄原核形成率較高，多精入卵現(xiàn)象也較高，而多精入卵并不能形成合子并發(fā)育。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在模擬奶牛IVF 所需的“原生境”條件下，發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)能夠支持奶牛精子形成雄原核并卵裂，研究結(jié)果可為揭示雄原核的形成機(jī)制及受精本質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為瀕危動(dòng)物保護(hù)提供了潛在的解決方案。