潘 軍，李鳳鳴，王彩蝶，李曉斌，張仕琦，張文杰，楊開倫*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830035；2.阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆阿克蘇 843000）

褪黑素（Melatonin，MT）在機體內(nèi)具有調(diào)控睡眠、增強機體抗氧化能力、提高免疫力、抗菌抗炎、抑制腫瘤和癌細胞等廣泛的生物學(xué)作用。在畜牧生產(chǎn)中MT具有調(diào)控動物繁殖、提高動物產(chǎn)絨量和絨毛質(zhì)量、提高蛋雞產(chǎn)蛋性能、降低奶牛體細胞數(shù)和乳房炎等作用。目前在畜牧業(yè)生產(chǎn)中主要通過改變飼養(yǎng)環(huán)境光照周期和時間，埋植、靜脈注射、腹腔注射MT及靜脈注射、腹腔注射、口服前體物質(zhì)色氨酸（Tryptophan，Trp）等方式來提高動物機體MT 水平，眾多方法中口服或補飼Trp 可能是簡便易行的操作方法。不同動物補喂或口服不同水平Trp 是否能提高動物機體5-羥色胺（Serotonin，5-HT）的水平尚存在爭議。并且通過不同灌注模式給牛皺胃灌注50 mg/kg 體重（BW）的Trp，發(fā)現(xiàn)頸靜脈血漿和血清中5-HT 濃度存在較大差異。然而上述Trp 調(diào)控機體MT 的研究中測定的均是動物頸靜脈血中MT 濃度，頸靜脈血主要反映大腦和松果體中合成的MT 回流至頸靜脈中，大腦和松果體中MT 的合成具有明顯的晝夜節(jié)律性。前人研究表明，除松果體外，腸道中也含有大量MT，約為松果體中400 倍。然而腸道中MT 合成是否具有節(jié)律性，前體物質(zhì)Trp 能否提高腸道MT 合成等問題仍需深入研究。本試驗旨在揭示Trp 對綿羊腸道MT 濃度的動態(tài)變化規(guī)律的影響，為畜牧業(yè)生產(chǎn)中通過飼喂Trp 的方式調(diào)控MT 提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料-色氨酸（新疆阜豐生物科技有限公司）的純度≥98%。

1.2 試驗時間和地點 試驗于2019 年11 月2 日至11月20 日在新疆昌吉惠康畜牧有限公司進行，試驗期間當(dāng)?shù)厝粘鰰r間為08:50—09:05，日落時間為18:50—18:40，外界環(huán)境溫度為-2～8℃，圈舍內(nèi)溫度為10～15℃。

1.3 試驗設(shè)計 選用4 只10～12 月齡、體重（37.92±1.35）kg的哈薩克綿羊母羊，先安裝十二指腸瘺管恢復(fù)2 個月后，再安裝肝門靜脈血管插管恢復(fù)15 d 后，按照自身對照試驗設(shè)計進行3 期灌注試驗，設(shè)為對照組（n=4）、1.2 g 灌注組（n=4）、4.8 g 灌注組（n=3）每天分別灌注含0、1.2、4.8 g/d 的Trp 生理鹽水溶液700 mL。灌注試驗按照從低濃度到高濃度的順序?qū)嵤?，每次同時用4 只羊灌注1 種濃度，用20 滴/mL 的輸液器改裝成灌注管，700 mL 灌注溶液每天分2 次灌注，每次灌注時長為（660±20）min，設(shè)置灌注速度為9.7 滴/min（即29.17 mL/min）。

1.4 飼養(yǎng)管理 試驗綿羊單欄飼養(yǎng)、自由飲水，參照NRC（2007）肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準配制試驗羊日糧配方，試驗羊日糧配方及營養(yǎng)成分見表1。試驗羊按照精粗比5:5 進行飼喂，每只羊每天飼喂精料為600 g/d（粗蛋白質(zhì)20.48%）、苜蓿青干草為400 g/d（粗蛋白質(zhì)15.62%）、麥秸為200 g/d（粗蛋白質(zhì)為5.64%）。粗飼料粉碎至2～3 cm 并按比例混合，每天分別于08:00、20:00 飼喂，并同時進行十二指腸灌注，日糧采用定量飼喂方式進行飼喂，以保證每只羊采食30 min 后料桶無剩料。

表1 日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.5 指標(biāo)測定 試驗連續(xù)灌注3 d，于第4 天用肝素鈉抗凝管采集試驗羊肝門靜脈全天08:00、09:00、10:00、11:00、12:00、13:00、14:00、17:00、20:00、21:00、22:00、23:00、00:00、01:00、02:00、05:00 共16 個時間點血液，用離心機3 500 r/min 離心15 min，吸取上清血漿到2 mL 凍存管中，置于冰箱-20℃保存待測。試驗羊血漿中MT 和5-HT 由北京華英生物技術(shù)研究所用酶免法測定，酶聯(lián)免疫試劑盒為北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，酶標(biāo)儀為華衛(wèi)德朗DR-200BS。試驗羊血漿中Trp和犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）參照Zhang 等方法用高效液相色譜法測定，色譜柱為（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為15 mmol/L 醋酸鈉溶液和乙腈（95:5，v/v），犬尿氨酸測定波長和出峰時間為360 nm，4 min以內(nèi)，色氨酸測定波長和出峰時間為278 nm，6 min 以內(nèi)。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 進行整理，用SPSS 21.0 軟件對各組血漿中MT、5-HT、Trp、Kyn 進行比較均值的單因素ANOVA 分析，差異顯著者采用Duncan's 法進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿MT 的影響由圖1 可知，08:00 飼喂后和20:00 飼喂后，對照組綿羊門靜脈血漿中MT 濃度均有提高趨勢；4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中MT 濃度在17:00、20:00、21:00、22:00、23:00、0:00、01:00 均高于對照組（<0.01）。由表2 可知，與對照組相比，1.2 g 灌注組綿羊門靜脈血漿MT 的總體均值低于對照組（>0.05），但4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿總體均值高于對照組（<0.01）。1.2 g灌注組綿羊白天門靜脈血漿中MT 濃度低于對照組和4.8 g 灌注組（<0.05），但4.8 g 灌注組綿與對照組差異不顯著。4.8 g 灌注組綿羊夜間門靜脈血漿中MT 濃度高于1.2 g 灌注組和對照組（<0.01），1.2 g 灌注組與對照組差異不顯著。由此說明，對照組綿羊門靜脈中MT 濃度沒有明顯的晝夜節(jié)律，采食會引起綿羊門靜脈MT 濃度提高，4.8 g 灌注組明顯提高了綿羊門靜脈血漿中MT 濃度和夜間門靜脈血漿MT 濃度。

圖1 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿MT 濃度的影響

表2 灌注不同劑量的Trp 對綿羊門靜脈血漿MT 濃度的影響 pg/mL

2.2 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿5-HT 的影響由圖2 可知，對照組綿羊門靜脈血漿中5-HT 濃度表現(xiàn)為10:00—14:00 高 于21:00—05:00（<0.01），對 照組綿羊門靜脈血漿中5-HT 濃度沒有明顯的晝夜節(jié)律，白天飼喂后4 h 內(nèi)有提高趨勢；4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中5-HT 動態(tài)時間點濃度在11:00、14:00、17:00、20:00、21:00、22:00、23:00、00:00、05:00 均高于對照組（<0.01）。與對照組相比，1.2 g 灌注組綿羊門靜脈血漿總體5-HT 濃度（>0.05）、白天5-HT 濃度均值（<0.05）、夜間5-HT 濃度均值（>0.05）均低于對照組。4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿總體5-HT 濃度、夜間5-HT 濃度均值均高于對照組（<0.01），白天門靜脈血漿5-HT 濃度與對照組差異不顯著。由此說明，對照組綿羊門靜脈中5-HT 濃度表現(xiàn)出白天飼喂后高于夜間，4.8 g 灌注組明顯提高了綿羊夜間門靜脈血漿中5-HT 濃度。

圖2 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿5-HT 的影響

表3 灌注不同劑量的Trp 對綿羊血漿5-HT 的影響 ng/mL

2.3 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿Trp 和Kyn 的影響 由圖3 可知，對照組綿羊門靜脈血漿中Trp 濃度無明顯的晝夜節(jié)律；飼喂Trp 后，無論白天和夜間都表現(xiàn)出綿羊門靜脈血漿中Trp 濃度開始降低，在飼喂后4 h開始升高。由表4 可知，1.2 g 和4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中Trp 總體濃度均高于對照組（<0.01），1.2 g灌注組綿羊門靜脈血漿白天和夜間Trp 濃度均值均高于對照組（<0.05），4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿白天和夜間Trp 濃度均值均高于對照組（<0.01）和1.2 g灌注組（>0.05）。白天和夜間門靜脈Trp 濃度均隨著灌注劑量的增加而增加，白天和夜間的門靜脈Trp 濃度無明顯差異。由此說明，通過十二指腸灌注Trp 能提高綿羊門靜脈血漿中Trp 濃度，并且綿羊門靜脈血漿中Trp 濃度隨著灌注劑量的提高而隨之提高。

圖3 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿Trp 的影響

由圖4 可知，對照組綿羊門靜脈血漿中Kyn 濃度無明顯的晝夜節(jié)律，在全天各個時間段變化幅度都不大。由表4 可知，1.2 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中Kyn 總體濃度和白天Kyn 濃度均值均高于對照組（<0.05），夜間Kyn 濃度均值高于對照組（>0.05）。4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中Kyn 總體濃度、白天Kyn 濃度均值和夜間Kyn 濃度均值均高于對照組（<0.01）和1.2 g灌注組（<0.01）。對照組、1.2 g 和4.8 g 灌注組Trp和Kyn 濃度在白天和夜間均無明顯差異，門靜脈中Kyn 濃度變化規(guī)律與Trp 相同。由此說明，通過十二指腸灌注Trp 能提高綿羊門靜脈血漿中Kyn 濃度，且綿羊門靜脈血漿中Kyn 濃度也隨Trp 灌注劑量的提高而提高。

表4 灌注不同劑量的Trp 對綿羊門靜脈血漿Trp 和Kyn 的影響 μg/mL

圖4 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿Kyn 的影響

3 討論

3.1 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿MT 的影響本試驗通過十二指腸灌注Trp 提高了4.8 g 灌注組門靜脈血漿中MT 濃度。Trp 是合成MT 的前體物質(zhì)，Trp在動物機體中首先在色氨酸羥化酶（TPH）的作用下轉(zhuǎn)化成5-羥基色氨酸（5-HTP），因此TPH 在腸道和松果體分布和表達量可能是影響松果體和腸道MT 合成的主要因素。通過靜脈注射、口服前體物質(zhì)Trp均能提高動物頸靜脈血液中MT 水平。然而關(guān)于增加機體Trp 劑量對人和動物門靜脈血漿中MT 的研究極少，大多數(shù)研究集中在對機體頸靜脈血漿MT 濃度的變化。Ma 等給山羊灌服瘤胃保護性Trp，提高了山羊血清中MT 水平，并且夜間血清MT 水平顯著高于白天。Paredes 等給斑鳩飼喂125、300 mg/kg BW 的Trp均能提高白天和夜間斑鳩翅下靜脈血清中MT 水平，并且夜間血清中MT 水平明顯高于白天。但Herichová 等給雞飼喂150 mg/kg BW 的Trp 提高了白天松果體中MT 水平，而白天和夜間血漿中MT 水平卻沒有明顯變化。Sánchez 等給大鼠服喂125 mg/kg BW 的Trp 不僅能刺激MT 合成，并且能提高MT 峰值和促進峰值提前。但是，Esteban 等給大鼠服喂300 mg/kg BW 的Trp 僅提高了夜間血漿MT 水平，而白天血漿MT 水平降低。以上結(jié)果表明，Trp 調(diào)控動物機體MT 合成在不同品種動物之間存在一定差異，不同Trp 劑量水平對動物白天和夜間血液中MT 濃度的影響也不相同，動物血液中MT 濃度并沒有隨著Trp 劑量的增加而呈現(xiàn)出增加趨勢或降低趨勢，這一結(jié)果與本試驗門靜脈結(jié)果具有相似性。

肝門靜脈匯集胃、脾臟、胰腺和腸道靜脈進入肝臟的血液，能直接反映腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)進入腸系膜靜脈并最終匯入門靜脈的情況。Huether 等給大鼠口服300 mg/kg BW 的Trp 同時結(jié)扎大鼠的門靜脈，大鼠外周循環(huán)血液中MT 的提高幅度顯著降低，此外大鼠灌服Trp 后10、20 min 門靜脈血漿中MT 水平均約為頸靜脈血漿MT 水平的4 倍，由此說明灌注Trp 在腸道中能迅速合成大量的MT。本試驗中，1.2 g 組和4.8 g 組灌注劑量分別為32 mg/kg BW 和126 mg/kg BW，1.2 g灌注組門靜脈MT 濃度顯著低于對照組，但4.8 g 灌注組門靜脈MT 濃度顯著高于對照組，約為對照組的1.5倍。這種差異一方面可能與灌注劑量、灌注模式有關(guān)；另一方面可能與Kyn 合成反應(yīng)中關(guān)鍵控制酶色氨酸2,3-雙加氧酶（Tryptophan 2,3-Dioxygenase，TDO）和吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine 2,3-Dioxygenase，IDO）競爭共同底物Trp 有關(guān)，最終導(dǎo)致MT 合成途徑Trp 代謝產(chǎn)物減少。本試驗中，1.2 g 灌注組門靜脈白天MT 濃度低于對照組，夜間與對照組無顯著差異，白天灌注后MT 濃度較低與TDO 和IDO 競爭底物濃度有關(guān)，可能還與灌注初期未達到該2 種酶的飽和度也有關(guān)；而夜間門靜脈血漿MT 濃度高于白天且與對照組無顯著差異，可能與夜間大腦和松果體中合成了大量MT，導(dǎo)致整個機體血液循環(huán)系統(tǒng)中MT 濃度升高有關(guān)。Bubenik 等研究發(fā)現(xiàn)，豬門靜脈血液中MT 濃度比肝動脈和后腔靜脈高，門靜脈血液MT 濃度的升高與采食有關(guān)，而與光周期無關(guān)，門靜脈血液MT 濃度無晝夜節(jié)律性。本試驗也顯示，對照組綿羊門靜脈血液MT 濃度無晝夜節(jié)律性。

3.2 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿5-HT 的影響 5-HT 作為大腦的神經(jīng)遞質(zhì)，參與了大腦中許多功能，Trp 是合成5-HT 和MT 的前體物質(zhì)。Mateos 等給大鼠連續(xù)7 d 口服125 mg/kg BW 的Trp，提高了大鼠白天和夜間頸靜脈血漿中5-HT 水平。本試驗中，4.8 g 灌注組也提高了門靜脈血漿5-HT 濃度。同時，Trp 會引起動物大腦5-HT 水平的顯著升高。松果體中5-HT 含量具有白天多夜間少的晝夜節(jié)律性，并且在夜間早期5-HT 濃度存在急劇增加的現(xiàn)象。但本試驗結(jié)果顯示，門靜脈血漿5-HT 均值在白天顯著高于夜間，4.8 g 灌注組增加了綿羊夜間門靜脈血漿中5-HT 濃度，但是表現(xiàn)出高低起伏的波動變化。Esteban 等認為，口服Trp 后會增加夜間MT 的合成，而合成MT 的底物5-HT 也會增加。門靜脈5-HT主要來源于腸道。Gershon 等報道，腸道黏膜嗜鉻細胞中含有大量5-HT，認為在腸道中亞型腸道嗜鉻細胞和血清素激活神經(jīng)元合成了5-HT。此外，不同的灌注模式也會影響5-HT 濃度。每天1 次或2 次灌注同等劑量的Trp 均顯著提高了牛頸靜脈血清中5-HT 濃度，但對血漿中5-HT 濃度無提高趨勢，24 h 持續(xù)灌注Trp 對頸靜脈血清和血漿中5-HT 濃度提高幅度非常有限。本試驗中，1.2 g 灌注組綿羊Trp 灌注量為32 mg/kg BW，灌注方式也是24 h 持續(xù)灌注，各個時間點門靜脈血漿中5-HT 濃度與對照組相比不僅無提高趨勢，反而低于對照組。機體攝入的Trp 除了用于合成蛋白質(zhì)外，其余Trp 約95% 經(jīng)Kyn 途徑代謝，Trp 轉(zhuǎn)化形成Kyn 過程的第一步反應(yīng)也是關(guān)鍵性控制步驟由TDO 和IDO 催化完成，TDO 和IDO 的活性會隨著Trp濃度的增加而提高，TDO 和IDO 活性的提高會促進Kyn 合成的增加，Kyn 合成增加會與5-HT 合成途徑競爭相同的底物Trp，最終導(dǎo)致5-HT 的合成減少。因此，機體中Trp 濃度只有超過了TDO 和IDO 的飽和度，額外的底物才會用于合成5-HT。本試驗中，白天開始灌注Trp 后1～4 h，1.2 g 和4.8 g 灌注組血漿中5-HT 濃度均低于對照組，可能與灌注初期未達到TDO和IDO 飽和度有關(guān)。

3.3 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿Trp 和Kyn 的影響 Trp 在動物體內(nèi)的分解代謝主要有Kyn、吲哚乙酸、5-HT 和MT 共4 條途徑，其中3 條途徑都分解成為小分子物質(zhì)。在成年哺乳動物中，機體攝入的Trp主要在肝臟中經(jīng)Kyn 途徑代謝（約95%），1%～2%在小腸中經(jīng)5-HT 途徑轉(zhuǎn)化成MT，2%～3%在腸道和肝臟中轉(zhuǎn)化成吲哚乙酸。在本試驗中，增加綿羊腸道中Trp 劑量，綿羊門靜脈中Trp 和Kyn 的濃度也增加，并且隨著Trp 灌注劑量的增加，綿羊肝門靜脈血漿中Trp和Kyn 濃度在白天和夜間均呈現(xiàn)出增加的趨勢。給荷斯坦牛皺胃灌注Trp 的研究結(jié)果也顯示，其頸靜脈血漿和血清中Trp 和Kyn 濃度變化具有相似性，Trp 和Kyn濃度隨著單次灌注劑量的增加而增加。本試驗再次證明了Kyn 是Trp 的主要代謝產(chǎn)物，并由此說明Trp在綿羊腸道中大量被吸收，Kyn 大量被合成，且與晝夜節(jié)律無關(guān)。肝臟有合成Kyn 的所有酶，90%的Kyn 在肝臟中合成，5%～10% 的Kyn 在肝臟外的其他組織中合成。從本試驗門靜脈中Kyn 濃度可以看出，合成Kyn 的酶不僅存在于肝臟，在腸道中也存在。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，綿羊門靜脈血中MT 的濃度呈現(xiàn)出白晝低、夜間和凌晨高的變化規(guī)律，白晝期間的濃度與采食有關(guān)，5-HT 濃度的變化規(guī)律與MT 相似；Trp灌注量為4.8 g 時顯著提高了夜間綿羊門靜脈血MT 和5-HT 濃度；綿羊門靜脈血漿中Trp 和Kyn 濃度均隨著Trp 灌注劑量的增加而提高。