王先坤 譚磊 徐凱文 李靜

摘要：為了解湖南省偽狂犬病毒（PRV）病原特征及遺傳變異情況，從湖南婁底某豬場(chǎng)采集疑似感染偽狂犬病（PR）病料，通過(guò)細(xì)胞傳代、PCR鑒定、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）等進(jìn)行病毒分離鑒定;對(duì)該毒株的gC、TK和gE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，分析其變異情況。結(jié)果表明，臨床病料接種PK15細(xì)胞后有1份樣品出現(xiàn)細(xì)胞病變，經(jīng)過(guò)PCR和IFA鑒定結(jié)果表明分離的毒株為PRV（命名為HuN-LD株），盲傳第6代病毒的滴度為107.5 TCID50/mL。與參考PRV毒株相比，該毒株gE、TK和gC基因序列與國(guó)內(nèi)流行變異株對(duì)應(yīng)序列同源性最高，與其他毒株同源性相對(duì)較低。基于gC基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化數(shù)分析結(jié)果表明，該毒株與國(guó)內(nèi)2011年后流行變異株親緣關(guān)系最近，屬于同一分支，但與國(guó)外流行的毒株（NIA3和Becker等）相隔較遠(yuǎn)，屬于不同分支。提示成功分離得到1株P(guān)RV變異株，該結(jié)果可為湖南省PRV流行病學(xué)研究及疫苗研發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病毒;分離鑒定;遺傳變異;進(jìn)化分析;湖南省

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65+1 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）10-0171-05

豬偽狂犬病（pseudorabies，PR）是由豬偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）感染所引起，該病原可感染多種動(dòng)物，包括豬、牛、羊和犬等，臨床癥狀主要包括腹瀉、發(fā)熱、腦炎和奇癢（豬除外）為主要特征[1-2]。豬為PRV的主要宿主，但不同發(fā)育階段豬群感染該病原后表現(xiàn)臨床癥狀均有所不同：仔豬出現(xiàn)腦炎和腹瀉等，育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，種公豬繁殖能力下降，繁殖母豬流產(chǎn)、死胎等[3]。目前，對(duì)于PR防控主要依靠使用標(biāo)記疫苗和相應(yīng)的鑒別診斷方法，部分國(guó)家或地區(qū)采用此策略成功控制或凈化該病。2011年前，我國(guó)主要依靠基于Bartha株研發(fā)的基因缺失弱毒疫苗來(lái)防控PR，且取得較好效果。自2011年冬季以來(lái)，我國(guó)部分省市豬場(chǎng)暴發(fā)PR，且這些豬場(chǎng)大部分均免疫接種過(guò)PRV弱毒疫苗，這提示傳統(tǒng)的PRV疫苗無(wú)法對(duì)目前流行的變異株提供完全保護(hù)，而進(jìn)一步序列分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)PRV變異株和傳統(tǒng)株部分抗原基因存在較大差異[4-5]。

PRV為DNA病毒，成熟的病毒粒子為球形，其基因組全長(zhǎng)約為143 kb，可編碼多種蛋白。gE、gI、TK、gC和gD等蛋白共同調(diào)控PRV的毒力，其中，gE為PRV的主要毒力基因，缺失該基因可導(dǎo)致保持毒株的免疫原性，但毒力會(huì)極大下降[6];TK基因編碼的胸苷激酶可參與病毒的潛伏感染;gC基因編碼的糖蛋白則可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，在病毒吸附和釋放等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，且該基因的變化可影響中和抗體的產(chǎn)生[7]。

湖南省生豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，但王昌建等的調(diào)查結(jié)果顯示，2018年湖南省部分地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)PRV-gE血清抗體陽(yáng)性率達(dá)21.0%，提示豬偽狂犬病在湖南地區(qū)廣泛流行，且野毒感染情況較為嚴(yán)重[8]。為初步調(diào)查湖南地區(qū)PRV流行株病原特征及基因變異情況，本研究首先通過(guò)細(xì)胞傳代、PCR檢測(cè)、間接免疫熒光檢測(cè)技術(shù)（IFA）對(duì)病原進(jìn)行分離及鑒定，其后測(cè)定該毒株的滴度并分析其對(duì)小鼠的致病性，最后通過(guò)PCR法對(duì)該毒株的gE、TK和gC基因序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，分析其基因變異情況，并分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系，以期為湖南省PRV分子流行病學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源、細(xì)胞及試驗(yàn)動(dòng)物

豬腎上皮細(xì)胞（PK15細(xì)胞），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院保存。腎臟、肺臟、腦、淋巴結(jié)等組織樣品于2019年8月初采集于河南省婁底市某疑似感染豬偽狂犬病的豬場(chǎng)，將樣品標(biāo)記后保存于 -20 ℃，待檢。12只4周齡雌性昆明小鼠，購(gòu)自于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑

DNA/RNA基因組提取試劑盒，購(gòu)于AXYGEN公司;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清等，購(gòu)于Gbico公司;ApexHF HS DNA 聚合酶預(yù)混液，購(gòu)于艾克瑞生物有限公司;DL 3000 DNA marker、50×TAE溶液等，購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購(gòu)于Omega公司;MLV反轉(zhuǎn)錄試劑，購(gòu)于Promega公司;Random Primer和dNTP mix，均購(gòu)于賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒分離 將組織病料送至湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，取腦組織、腎臟和淋巴結(jié)樣品剪碎后置于離心管內(nèi)，加入適量滅菌PBS溶液和鋼珠，勻漿后反復(fù)凍融3次，低溫（4 ℃）高速（13 000 r/min）離心5 min，獲得上清，采用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。取100 μL濾液接種于單層的PK15細(xì)胞，2 h后棄去病毒液，采用PBS溶液清洗后加入含2%血清DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d，期間觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)病變。

1.3.2 PCR/RT-PCR鑒定、目的基因擴(kuò)增及分析 當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，收獲細(xì)胞上清，采用DNA/RNA提取試劑盒提取基因組核酸，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄步驟將基因組中RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中PRV 全基因序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)特異性引物，采用于PRV的分子鑒定和gE、gC、TK全基因擴(kuò)增（表1），同時(shí)參考豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）的ORF5基因、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）的ORF2基因和豬瘟病毒（CSFV）的NCR基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性檢測(cè)引物，引物均由擎科生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（25.0 μL）：ApexHF HS DNA 聚合酶預(yù)混液 12.5 μL、DNA/cDNA模板2.0 μL、上下游引物各0.5 μL及滅菌雙蒸水9.5 μL;PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s，56～58 ℃ 15 s，72 ℃ 30～60 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果返回后，將序列拼接，同時(shí)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PRV參考毒株的對(duì)應(yīng)序列，用DNA star 5.0軟件分析本研究獲得毒株的gE、gC和TK基因序列與參考序列的同源性;同時(shí)用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建gC基因序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)，其Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.3.3 間接免疫熒光（IFA）鑒定 取適當(dāng)稀釋的病毒上清接種于單層PK15細(xì)胞，孵育1 h后棄上清，加入適量含2% NBCS的DMEM培養(yǎng)基 在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。其具體步驟如下：（1）棄去培養(yǎng)基，采用PBS洗滌3次;（2）加入4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，PBS洗滌3次; （3）含0.1% Triton-100 PBS溶液室溫孵育10 min，PBS洗滌3次;（4）含3% BSA的PBS溶液室溫封閉1 h;（5）采用鼠源PRV-gE單克隆抗體（1 ∶1 000）室溫孵育4 h，其后PBS洗滌5次;（6）FITC標(biāo)記的驢抗鼠熒光二抗（1 ∶3 000）室溫孵育45 min，PBS洗滌5次;（7）最后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照保存。

1.3.4 病毒滴度測(cè)定 將該毒株純化后連續(xù)擴(kuò)增傳6代，取第6代病毒進(jìn)行10倍稀釋后分別接種于PK15單層細(xì)胞（培養(yǎng)于96孔板），每個(gè)稀釋度作8個(gè)重復(fù)，每個(gè)孔接種100 μL病毒，并設(shè)置陰性對(duì)照（接種100 μL DMEM培養(yǎng)基）。將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)3 d，其后觀察各孔細(xì)胞病變情況，并按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.3.5 動(dòng)物試驗(yàn) 將12只4周齡的雌性昆明小鼠隨機(jī)分為2組，每組6只小鼠，設(shè)置為對(duì)照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組小鼠分別接種100 μL 105 TCID50/0.1 mL 的病毒，接種途徑為腿部肌肉注射;對(duì)照組小鼠分別于腿部肌肉注射100 μL DMEM培養(yǎng)液。接種后每日觀察小鼠臨床癥狀及死亡情況，72 h后將各組存活小鼠處死，取腦組織提取基因組后進(jìn)行PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

將組織病料處理后，提取組織中病毒核酸，通過(guò)PCR/RT-PCR對(duì)PRV、PCV2、PRRSV和CSFV特定基因進(jìn)行檢測(cè)，由圖1可知，樣品中僅檢出PRV gG特異性核酸，其PCR產(chǎn)物大小約為440 bp，但未檢測(cè)出其他病原核酸（圖略）。

2.2 病毒分離結(jié)果

將組織處理后取上清接種于單層PK15細(xì)胞，由圖2可知，24 h后可見(jiàn)接毒后細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、融合和拉絲等，而空白對(duì)照組細(xì)胞未出現(xiàn)細(xì)胞病變。

2.3 分離毒株IFA鑒定

將分離的毒株接種于PK15細(xì)胞，24 h后進(jìn)行IFA鑒定。由圖3可知，接種病毒的部分PK15細(xì)胞可見(jiàn)明顯綠色熒光，而對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)綠色熒光。由于感染該病毒的細(xì)胞可被PRV單克隆抗體特異性識(shí)別，因此本研究分離的毒株為PRV（命名為HuN-LD株）。

2.4 PRV目的基因擴(kuò)增及分析

采用DNA提取試劑盒提取第6代PRV病毒基因組，采用PCR法對(duì)該毒株的gE、gC和TK基因進(jìn)行擴(kuò)增。由凝膠電泳結(jié)果（圖4）可知，該毒株的gE、TK和gC基因分別擴(kuò)增約1 900、1 200、1 800 bp條帶，與預(yù)期片段大小一致。

基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果表明，PRV HuN-LD株gE、TK和gC基因與國(guó)內(nèi)流行的PRV變異株（如JS-2012株、HeN1201株、TJ株和JXCH株等）對(duì)應(yīng)序列同源性分別為99.4%～99.9%、99.7%～100.0%和99.8%～100.0%，與國(guó)內(nèi)2011年前流行的毒株（Ea株和Fa株）和國(guó)外流行毒株（Bartha株、NIA3株和Becker株等）同源性相對(duì)較低。

為進(jìn)一步分析本研究獲得的PRV毒株與其他參考毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，基于PRV gC基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)種系發(fā)育樹(shù)。由圖5可知，所有PRV毒株在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上可分為2個(gè)基因型分支，分別為基因1型和2型，本研究獲得毒株（HuN-LD株）與國(guó)內(nèi)流行的變異株（如HN1201株和JS-2012株）聚為同一分支，與國(guó)內(nèi)流行的傳統(tǒng)株（Ea株和Fa株）相隔較近，均屬于基因2型;而國(guó)外流行的毒株（如Bartha株和Becker株）屬于基因1型，與本研究獲得的毒株所屬分支相隔較遠(yuǎn)。因此，本試驗(yàn)獲得的毒株應(yīng)屬于PRV變異株。

2.5 TCID50測(cè)定與動(dòng)物試驗(yàn)

將第6代病毒梯度稀釋后接種于96孔板的PK15細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后通過(guò)觀察各稀釋組出現(xiàn)細(xì)胞病變情況計(jì)算該病毒的TCID50值。結(jié)果顯示，該病毒的滴度為107.5 TCID50/mL。將該病毒稀釋至106.0 TCID50/mL，給試驗(yàn)組小鼠各接種100 μL，接種24 h后臨床觀察可見(jiàn)試驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)呼吸急促、奇癢等癥狀，于36～48 h小鼠全部死亡，而對(duì)照組小鼠無(wú)異常表現(xiàn)。剖檢各組小鼠，可發(fā)現(xiàn)接種病毒組小鼠腦組織充血或出血，其他臟器無(wú)明顯病變，對(duì)照組小鼠各組織臟器均正常。進(jìn)一步PCR驗(yàn)證結(jié)果也確定試驗(yàn)組小鼠腦組織存在PRV核酸，而對(duì)照組為PRV核酸陰性。

3 討論

豬偽狂犬病是一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)威脅巨大的重要傳染病之一，該病可導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)腹瀉、嘔吐和神經(jīng)癥狀等，伴隨高發(fā)病率和死亡率;母豬和種公豬出現(xiàn)繁殖障礙，前者一般為流產(chǎn)、死胎等，而種公豬則表現(xiàn)睪丸炎和精液品質(zhì)下降等，且精液中也可攜帶病毒，對(duì)其他健康待配種豬群造成威脅[9-10]。當(dāng)前，對(duì)于偽狂犬病的防控主要依賴(lài)于疫苗免疫接種和相應(yīng)的鑒別診斷策略，近30年來(lái)國(guó)外使用基于Bartha株研發(fā)的基因缺失疫苗對(duì)偽狂犬病的防控取得了較好的效果，但2011年以來(lái)部分已接種傳統(tǒng)疫苗的豬場(chǎng)仍然暴發(fā)偽狂犬病，且進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明這些毒株與傳統(tǒng)毒株的抗原基因存在較大差異，這可能是導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗對(duì)當(dāng)前流行的PRV變異株防控效果不理想的主要原因[11]。

本研究從湖南婁底某免疫Bartha株仍發(fā)病豬場(chǎng)分離獲得1株病毒，通過(guò)PCR檢測(cè)、IFA檢測(cè)和細(xì)胞病變情況可將其鑒定為PRV毒株（HuN-LD株）;其后將該病毒人工感染昆明小鼠，可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和死亡，最終在死亡小鼠腦組織中也檢測(cè)到了PRV核酸，其結(jié)果提示該毒株對(duì)小鼠具有較高的致病性，但對(duì)豬的致病性還需要進(jìn)一步試驗(yàn)探究。

PRV屬于皰疹病毒科成員，其基因組較大（約143 kb），可編碼至少72種蛋白，其中部分編碼蛋白與病毒毒力或免疫相關(guān)，其中g(shù)E、PK等基因主要病毒的毒力或致病性等相關(guān)，gC糖蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，在病毒吸附、釋放等過(guò)程發(fā)揮重要作用[3，12]。由于PRV基因組龐大，這導(dǎo)致擴(kuò)增其全基因組序列分析基因變異情況相對(duì)困難，所以研究人員一般通過(guò)分析這些與免疫及毒力相關(guān)基因序列信息來(lái)初步確定毒株基因組變異情況。本研究通過(guò)對(duì)PRV HuN-LD株的gE、TK和gC基因序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，發(fā)現(xiàn)與國(guó)內(nèi)流行變異株相比，其核苷酸序列僅部分位點(diǎn)出現(xiàn)堿基替換或變異，提示當(dāng)前變異株主要毒力或免疫基因在核苷酸或氨基酸水平上具有較高的保守性[3]。

基于gC基因構(gòu)建PRV系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析本研究獲得毒株與GenBank收錄的國(guó)內(nèi)外具有代表性PRV毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的毒株可與國(guó)內(nèi)流行的變異株（如JS-2012株和HN1201株）聚為同一分支，與國(guó)內(nèi)流行的PRV傳統(tǒng)株（如Ea株）和國(guó)外流行毒株（疫苗株）相距較遠(yuǎn)，提示本研究分離毒株屬于PRV變異株。雖然，目前大部分豬場(chǎng)通過(guò)加強(qiáng)免疫接種疫苗（如Bartha或HB-98疫苗）可有效防控PRV野毒感染，但目前我國(guó)PRV流行情況仍然不容客觀，這可能主要與許多散養(yǎng)戶(hù)未免疫接種PRV相關(guān)疫苗或養(yǎng)殖水平較低等有關(guān)[12]，但這也提示我們需要研發(fā)以PRV變異株為親本的新型疫苗，這樣可能對(duì)豬偽狂犬病的防控更為有效。

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