王維亞，黃瑞鈺，駱 瑜，吳珊珊，劉玉婷，李金林

（1.南昌市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，南昌市食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330012；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330022）

腐乳是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，因其質(zhì)地細(xì)膩、口感香醇、味道鮮美，是一種不可多得的佐餐佳品，同時(shí)含有人體所需要的多種微量元素，被稱為“東方奶酪”[1]。研究表明，腐乳具有抗氧化、降膽固醇、降血壓[2-3]等多種生理功能，且經(jīng)過(guò)發(fā)酵之后，更容易被人體消化吸收。發(fā)酵食品中的微生物諸如芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭菌屬（Clostridium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）均能產(chǎn)生脫羧酶[4-5]，使食品中的氨基酸脫羧產(chǎn)生生物胺。生物胺本身在機(jī)體中發(fā)揮多種生理功能，是正常的活性物質(zhì)[6]，但是當(dāng)質(zhì)量濃度過(guò)高身體就會(huì)出現(xiàn)偏頭痛、胃部痙攣、嘔吐、腹瀉、過(guò)敏等中毒癥狀[7]，其中毒性最大的是組胺和酪胺[8]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，腐乳、醬油、蝦醬和干腌魚等發(fā)酵食品中生物胺水平較高[9-10]。腐乳中豐富的游離氨基酸在微生物的作用下容易脫羧生成生物胺[11]，并發(fā)生生物胺積累現(xiàn)象，且不同類型腐乳中生物胺的種類和含量存在明顯差別[12]，腐乳中常見的生物胺有6種：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺[13]。

江西生產(chǎn)腐乳的歷史悠久，但氣候溫濕，適合微生物繁殖，對(duì)腐乳食用安全產(chǎn)生不利影響。因此，本文采用高效液相色譜法對(duì)江西產(chǎn)腐乳生物胺含量水平進(jìn)行調(diào)查分析，同時(shí)采用表型鑒定和基因型16S rDNA測(cè)序技術(shù)從產(chǎn)胺量較高的腐乳中分離鑒定具有產(chǎn)生物胺能力的菌株，從而對(duì)其食用安全性評(píng)價(jià)提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12種市售腐乳 產(chǎn)地均為江西，樣品具體信息見表1；色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺、精胺、1,7-二氨基庚烷、丹磺酰氯 純度≥97%，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乙腈、丙酮 色譜純，默克股份兩合公司；L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、谷氨酸鈉、5′-磷酸吡多醛、碳酸鈣、溴甲酚紫（分析純）、乙酸、乙酸銨（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、乙醚 分析純，西隴化工股份有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、dNTP、PCR引物 上海生工生物工程有限公司；DreamTaq-TM DNA Polymerase MBI Fermentas公司；胰酪大豆胨瓊脂（Trypticase Soy Agar，TSA）培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體（Trypticase Soy Broth，TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉 北京陸橋股份有限公司。

1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Rotanta 460醫(yī)用冷凍離心機(jī) 德高Hettich公司；DM1000顯微鏡 德國(guó)Leica公司；MJ-150-I生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HVA-85高溫蒸汽滅菌器 日本HIRAYAMA制造公司；Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GenoSens 1880型凝膠成像儀 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腐乳生物胺含量測(cè)定

1.2.1.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 參照國(guó)標(biāo)GB 5009.208-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測(cè)定》第一法高效液相色譜法，配制生物胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.0～50.0 mg/L。

1.2.1.2 樣品的提取和衍生 生物胺的提取和衍生參考GB 5009.208-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測(cè)定》和李大偉等[12]的方法有所改進(jìn)。取5 g腐乳于25 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液，加入10 mL 50 mg/mL三氯乙酸溶液振蕩提取30 min，4 ℃環(huán)境下6000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL容量瓶中，殘?jiān)?0 mL 50 mg/mL三氯乙酸溶液再提取1次，合并上清液并定容至刻度。

取0.5 mL上述溶液于15 mL離心管中，依次加入200 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、300 μL飽和碳酸氫鈉溶液、1 mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液（溶劑為丙酮），渦旋數(shù)秒后置于60 ℃恒溫水浴鍋中衍生30 min，隔15 min振蕩1次。取出，加入100 μL 50 mg/mL谷氨酸鈉溶液（溶劑為飽和碳酸氫鈉溶液），混勻后60 ℃恒溫反應(yīng)15 min。取出，冷卻至室溫，加入0.3 g氯化鈉渦旋數(shù)秒，加入5 mL乙醚，振蕩后靜置分層，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相（乙醚層）于15 mL離心管中，水相（下層）再萃取1次，合并2次乙醚萃取液，40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?。加? mL乙腈振蕩混勻，使殘留物溶解，0.22 μm 濾膜針頭濾器過(guò)濾，待測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)溶液同法衍生。

1.2.1.3 高效液相色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動(dòng)相 A 為乙腈，流動(dòng)相 B為含體積分?jǐn)?shù)為0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，流速0.8 mL/min，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedures

1.2.2 產(chǎn)生物胺菌株的篩選

1.2.2.1 培養(yǎng)基配制 參考文獻(xiàn)的方法稍作調(diào)整配制如下培養(yǎng)基[14-16]。

生物胺初篩培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、氯化鈉5.0、碳酸鈣1.0、溴甲酚紫0.06、瓊脂20、前體氨基酸（L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸）各2.0、蒸餾水，pH 5.1～5.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

氨基酸TSB培養(yǎng)基（g/L）：TSB 30、5′-磷酸吡多醛0.05、前體氨基酸（L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸）各1.0、蒸餾水，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2.2 產(chǎn)胺菌的分離純化 取10 g腐乳于90 mL生理鹽水中，充分勻質(zhì)，制成1:10的樣品懸液，取1 mL樣品懸液以10倍梯度制成1:100和1:1000梯度濃度。各質(zhì)量濃度懸液吸取100 μL樣液分別涂布到生物胺初篩培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)48 h。挑取平板上不同形態(tài)的藍(lán)紫色菌落，在初篩培養(yǎng)基上多次劃線分離，觀察菌落形態(tài)特征，并接種至TSA平板上保存。

1.2.2.3 產(chǎn)胺菌的復(fù)篩 將上述純化后的菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)24 h，取0.5 mL菌懸液至氨基酸TSB培養(yǎng)基中，36 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)72 h，取1 mL培養(yǎng)液，加入1 mL 50 mg/mL三氯乙酸溶液，振蕩數(shù)秒，4 ℃環(huán)境下12000 r/min離心10 min，取0.5 mL上清液按1.2.1.2小節(jié)中樣品處理方法測(cè)定生物胺含量。

1.2.3 產(chǎn)生物胺菌株的鑒定

1.2.3.1 產(chǎn)胺菌的形態(tài)學(xué)觀察 觀察菌株在TSA平板上的菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察其大小、顏色、形狀等特征。

1.2.3.2 產(chǎn)胺菌的分子生物學(xué)鑒定 總DNA的提?。喊凑誆zup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒說(shuō)明書上的方法進(jìn)行。

PCR擴(kuò)增：采用細(xì)菌 16S rDNA 基因的通用引物，正向引物為 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG -3'，反向引物為 1492R：5'-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3'；熱循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，循環(huán)30次后，72 ℃延伸10 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，目標(biāo)物送至南昌科暢生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。采用SPSS Statistics V 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺的含量測(cè)定

2.1.1 生物胺標(biāo)曲和圖譜 由圖1～圖2可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的9種生物胺和內(nèi)標(biāo)在32 min內(nèi)得到較好分離，各生物胺的回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表3所示。結(jié)果表明，9種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，在1.0～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.998），說(shuō)明用該方法來(lái)測(cè)定生物胺具有良好的可靠性。

表3 生物胺的保留時(shí)間、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Retention time, the regression equations and correlation coefficients of biogenic amines

圖 1 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of biogenic amines standards

圖 2 腐乳中生物胺的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of biogenic amines in sufu

2.1.2 腐乳樣品中生物胺的含量水平 12種江西產(chǎn)腐乳的生物胺含量如表4所示，不同品牌的腐乳和同一品牌不同系列腐乳的生物胺含量存在顯著性差異（P＜0.05），這可能與添加的輔料混合物的種類、發(fā)酵菌種、儲(chǔ)存條件、加工工藝條件和加工環(huán)境有關(guān)[17-18]。樣品中共檢測(cè)到7種生物胺，其中色胺、腐胺、組胺和酪胺是主要生物胺，所有樣品中均檢測(cè)到腐胺和酪胺，且這2種生物胺平均含量較高，此結(jié)果與劉振鋒[19]的研究相符。12種腐乳中均未檢測(cè)到章魚胺和亞精胺。本次調(diào)查的腐乳樣品中總生物胺含量范圍為68.5～1084.0 mg/kg，其中2A、3A和12E 3個(gè)樣品總生物胺含量均超過(guò)1000 mg/kg。文獻(xiàn)[20-21]報(bào)道食品中的總生物胺含量超過(guò)1000 mg/kg對(duì)健康有風(fēng)險(xiǎn)，其中，毒性最大的組胺，在食品中允許的最大含量為50～100 mg/kg[22]，當(dāng)組胺攝入量為8～40、40～100和高于100 mg時(shí)分別可能引起輕度、中度和重度中毒[23]。此次調(diào)查中1、11E和12E 3個(gè)樣品組胺含量均超過(guò)90 mg/kg，接近100 mg/kg的限值。食用發(fā)酵豆制品的國(guó)家主要集中在亞洲，然而亞洲各國(guó)對(duì)發(fā)酵豆制品中的生物胺含量沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此，了解發(fā)酵豆制品中的生物胺含量能夠規(guī)范發(fā)酵豆制品市場(chǎng)，提高發(fā)酵豆制品的安全性，為制定其相應(yīng)的生物胺標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

表4 腐乳樣品中生物胺含量 （mg/kg）Table 4 Contents of biogenic amines in sufu samples (mg/kg)

2.2 腐乳中產(chǎn)胺菌的分離鑒定

2.2.1 產(chǎn)胺菌的分離純化 生物胺初篩培養(yǎng)基原理是基于培養(yǎng)基中含有多種氨基酸前體和溴甲酚紫顯色劑，如果細(xì)菌能夠?qū)⑦@些前體氨基酸脫羧即可生成堿性生物胺，而溴甲酚紫在堿性環(huán)境下顯紫色，根據(jù)顏色變化即可分離出疑似生物胺產(chǎn)生菌[24]。挑取藍(lán)紫色菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，從4種（2A、3A、5B、12E）生物胺含量較高的腐乳中初步分離篩選到12株單菌落。

2.2.2 產(chǎn)胺菌產(chǎn)胺能力的液相測(cè)定結(jié)果 經(jīng)高效液相色譜確認(rèn)，12株菌中有3株不產(chǎn)生物胺，其余9株產(chǎn)胺菌編號(hào)為F1～F9，其產(chǎn)胺情況如表5所示。每株菌能產(chǎn)2～3種生物胺，F(xiàn)2、F3、F5、F6、F8和F9的產(chǎn)胺能力較強(qiáng)，總生物胺含量范圍為93.8～369.2 mg/L。其中，F(xiàn)2產(chǎn)苯乙胺、腐胺和酪胺能力最強(qiáng)，分別80.1、

表5 菌株的生物胺生成情況 （mg/L）Table 5 Biogenic amine contents produced by strains (mg/L)

66.4和22 2.7 mg/L；F5、F8和F9均產(chǎn)色胺、腐胺和組胺，生物胺總量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；F6的色胺產(chǎn)生能力最強(qiáng)，為85.3 mg/L。雖然生物胺的積累可能與不同種的微生物有關(guān)，但也有研究報(bào)道相較于微生物的種類來(lái)說(shuō)，其細(xì)菌菌株本身對(duì)于生物胺的形成有更大的影響，這可能是由于不同菌株的產(chǎn)氨基酸脫羧酶能力不同[25]。

2.2.3 產(chǎn)胺菌的形態(tài)學(xué)鑒定 選擇產(chǎn)胺量較高的6株菌，觀察在TSA平板上的形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如表6所示，結(jié)果表明，F(xiàn)3是革蘭氏陽(yáng)性桿菌、F6是革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌，其余都是革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性桿菌、革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌、革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌進(jìn)行顯微鏡下觀察菌落特征，結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出，革蘭氏陽(yáng)性桿菌呈正圓柱形，菌體大多平直，亦有稍彎曲的，排列分散存在，無(wú)一定排列形式，偶有成對(duì)或鏈狀。革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌呈圓形或卵圓形，單生或形成短鏈，有的直徑大于菌體，使菌體膨大呈梭狀，革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌形態(tài)為圓形，排列成葡萄串狀。

表6 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定Table 6 Morphological identification of strains

2.2.4 產(chǎn)胺菌的分子生物學(xué)鑒定 對(duì)6株高產(chǎn)生物胺菌株進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖4所示，在1400 bp左右出現(xiàn)了清晰明亮的擴(kuò)增條帶，說(shuō)明PCR擴(kuò)增成功。

圖 3 菌株的革蘭氏染色Fig.3 Gram staining of strains F3、F5 and F6

圖 4 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products

將上述的測(cè)序結(jié)果在NCBI-Blast數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，其結(jié)果如表7所示。

表7 16S rDNA 序列 Blast 比對(duì)Table 7 Blast analysis of 16S rDNA sequences

胡鵬[26]介紹食品中生物胺的主要制造者是食品中的微生物，主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella Trevisan）、變形桿菌屬（Proteus）、沙門氏菌屬（Salmonella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、微球菌屬（Micrococcus cohn）等。本實(shí)驗(yàn)得到的6株高產(chǎn)生物胺菌株中有4株為芽孢桿菌屬，其中F5、F8和F9同為耐硼賴氨酸芽孢桿菌，且分別來(lái)自不同品牌腐乳，其產(chǎn)胺種類和產(chǎn)胺能力相近，魯梅利桿菌和皮脂葡萄球菌的產(chǎn)胺特性還鮮有報(bào)道。研究表明，原料中產(chǎn)生物胺微生物的種類和數(shù)量與其產(chǎn)品中生物胺含量密切相關(guān)[27]，可通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、鹽度及pH，抑制菌株生長(zhǎng)活性，減少氨基酸脫羧酶表達(dá)，降低生物胺含量[28-29]。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)分離鑒定出的產(chǎn)胺菌，明確影響其生長(zhǎng)及產(chǎn)生物胺能力的理化因素，采取針對(duì)性措施降低腐乳中生物胺含量，是后續(xù)研究的方向。

傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品發(fā)酵過(guò)程中雖然有優(yōu)勢(shì)菌群起主導(dǎo)作用，但由于自然發(fā)酵、特殊的多工序、開放式或半開放式生產(chǎn)方式，實(shí)際上傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品生產(chǎn)是一個(gè)多菌種混菌發(fā)酵過(guò)程，微生物主要來(lái)自于曲種和環(huán)境[30]。腐乳中豐富的游離氨基酸和多菌種混菌發(fā)酵過(guò)程決定其高水平生物胺含量?？赏ㄟ^(guò)對(duì)加工過(guò)程制定良好操作規(guī)范，減少環(huán)境微生物，改進(jìn)加工工藝，抑制產(chǎn)胺菌的活性來(lái)控制生物胺的產(chǎn)生，提高產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全性。

3 結(jié)論

本研究的江西產(chǎn)腐乳樣品中檢測(cè)的生物胺含量范圍為68.5～1084.0 mg/kg，其中2A、3A和12E 3個(gè)樣品生物胺含量超過(guò)建議的1000 mg/kg限值。共檢測(cè)出7種生物胺，所有腐乳樣品腐胺和酪胺平均含量最高，不同品牌的腐乳和同一品牌不同系列的腐乳其生物胺含量存在顯著性差異（P＜0.05）。運(yùn)用生物胺顯色培養(yǎng)基初篩、高效液相色譜確認(rèn)結(jié)合16S rDNA測(cè)序技術(shù)分離鑒定出6株高產(chǎn)生物胺的菌株，耐熱芽孢桿菌（Bacillus sporothermodurans）1株，魯梅利桿菌（Rummeliibacillus stabekisii）1株，耐硼賴氨酸芽孢桿菌（Lysinacillus boronitolerans）3株和皮脂葡萄球菌（Staphylococcus piscifermentans）1株。本研究為發(fā)酵豆制品中生物胺限量標(biāo)準(zhǔn)的制定以及進(jìn)一步探清如何抑制腐乳中產(chǎn)胺菌的活性提供了理論研究基礎(chǔ)。