張令文，李欣欣，王雪菲，胡新月，計(jì)紅芳, ，畢繼才

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南信陽(yáng) 464399）

小麥蛋白是小麥粉的第二大組分。根據(jù)小麥蛋白在不同溶劑溶解度不同，可將小麥籽粒中的蛋白質(zhì)分為溶于水和稀鹽溶液的清蛋白、不溶于水但溶于10% NaCl溶液的球蛋白、溶于70%～90%乙醇溶液的醇溶蛋白和溶于稀酸和稀堿溶液的麥谷蛋白四類[1]。其中，醇溶蛋白和麥谷蛋白被稱為貯藏蛋白或面筋蛋白，是小麥蛋白重要組成成分，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。

面筋蛋白具有獨(dú)特的黏彈性、延伸性、吸水性、薄膜成型性和阻油能力，其含量、組成和性質(zhì)能夠影響面粉及其面制品，甚至肉制品的品質(zhì)。面筋蛋白的添加能夠改善面團(tuán)的粉質(zhì)參數(shù)指標(biāo)[3]。隨著面筋蛋白含量的增加，混粉的面團(tuán)粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)升高，但面團(tuán)吸水率影響較小[4]。面筋蛋白質(zhì)量能夠影響蒸煮面條浸泡過(guò)程中的質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定性，添加面筋蛋白可以提高豬肉糜凝膠的形成能力[5-6]。不同品種小麥來(lái)源的面筋蛋白在生產(chǎn)加工時(shí)常被混合使用，這不僅有礙優(yōu)良品種的小麥被充分利用，一定程度上也造成了小麥原料的極大浪費(fèi)。本文較系統(tǒng)研究了10種不同品種小麥面筋蛋白的水化性質(zhì)和表面性質(zhì)，并探討了面筋蛋白的巰基、二硫鍵及二級(jí)結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果有望為面筋蛋白的選擇性利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10個(gè)品種小麥：豫保1號(hào)、鄭麥103、周麥18Ⅱ、百農(nóng)307、百農(nóng)201、百農(nóng)207、百農(nóng)418、百農(nóng)4199、師欒02-1、新麥26 均來(lái)自河南新鄉(xiāng)延津小麥產(chǎn)區(qū)（2018年產(chǎn)）；牛血清蛋白 上海金穗生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍(lán) 天津市光復(fù)精細(xì)化研究所；氯化鈉、硫酸鉀 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、尿素、濃硫酸、乙醇 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硫酸銅、磷酸二氫鉀 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

TGL-15B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；WFG7200可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；ME-104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；XHF-D高速分散器內(nèi)切式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；XK96-B快速混勻器 姜堰市醫(yī)療器械有限公司；SHA-C水浴振蕩器 江蘇金壇市中大儀器廠；TM2300凱氏定氮儀 美國(guó)FOSS KJELTEC。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小麥面筋蛋白的制備 將10個(gè)品種的小麥實(shí)驗(yàn)室制粉（出粉率65%左右）后參照張克等[7]的方法制備面筋蛋白。制備的濕面筋真空冷凍干燥后粉碎過(guò)80目篩，避光保存。

1.2.2 蛋白含量測(cè)定 參照GB/T 5009.5-2010凱氏定氮法測(cè)定小麥粉和面筋蛋白中的粗蛋白含量，蛋白質(zhì)的換算系數(shù)取5.7。

1.2.3 持水性 參考Benelhadj等[8]的方法并部分修改。稱取蛋白樣品1 g（記作m0）置于離心管稱重（記作m1）。加入15 mL蒸餾水，快速混勻后室溫靜置0.5 h。6000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min。棄去上清液后稱重（記作m2）。持水性計(jì)算公式為：

1.2.4 持油性 參考Benelhadj等[8]的方法并部分修改。稱取蛋白樣品1 g（記作m0）置于離心管稱重（記作m1）。加入15 mL大豆油，快速混勻后室溫靜置0.5 h。6000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min。棄去上清液后稱重（記作m2）。持油性計(jì)算公式為：

1.2.5 起泡性及泡沫穩(wěn)定性 參考He等[9]的方法并稍作修改。取20 mL（記作V）的1.5%（w/v，g/mL）面筋蛋白樣品混懸液進(jìn)行均質(zhì)，并讀取此時(shí)樣品體積（V1，mL），室溫放置0.5 h，再次讀取體積（V2，mL）。起泡性和泡沫穩(wěn)定性計(jì)算公式為：

1.2.6 乳化性 參考Jain等[10]的方法。將0.5 g樣品與20 mL蒸餾水?dāng)嚢杌靹?，置于搖床0.5 h后4000 r/min離心15 min。取15 mL的上清液并與5 mL大豆油攪拌均勻，均質(zhì)后由底部吸0.5 mL與5 mL的0.1% SDS搖勻。以0.1% SDS（w/v，g/mL）為對(duì)照，立即于500 nm測(cè)定吸光度（記作A0）。乳化性（EAI）計(jì)算公式為：

式中：N表示稀釋倍數(shù)（10）；θ表示油相體積（0.25）；L表示比色皿厚度（0.1 cm）；C表示蛋白質(zhì)濃度（0.025 g/mL）。

1.2.7 表面疏水性 參考賈娜等[11]的方法。用0.02 mol/L PBS（pH7.0）緩沖液將面筋蛋白配制為濃度為8 mg/mL的蛋白溶液，取1 mL蛋白溶液中加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)（BPB），混勻后，于4800 r/min下離心15 min，留上清液去沉淀，將上清液稀釋10倍，595 nm處測(cè)定其吸光度，以PBS緩沖溶液為對(duì)照組。表面疏水性計(jì)算公式為：

1.2.8 游離巰基和二硫鍵 參考王洪偉等[12]的方法，采用DTNB比色法測(cè)定面筋蛋白的游離巰基和總巰基含量，通過(guò)計(jì)算得出二硫鍵含量。計(jì)算公式分別為：

式中：73.53=106/（1.36×104），1.36×104為Ellan試劑的摩爾消光系數(shù)，L/（mol·cm）；A412nm為波長(zhǎng)412 nm處所測(cè)得的吸光度；ρ為蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL；D為稀釋因子，對(duì)游離巰基測(cè)定中的D值取6.04。

式中：D為稀釋因子，取值為15；ρ為蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL；A412nm為412 nm波長(zhǎng)處所測(cè)得的吸光度。

二硫鍵含量計(jì)算公式為：

1.2.9 傅里葉紅外光譜的測(cè)定 參考Liu等[13]的方法，將面筋蛋白與KBr在紅外燈下以1:100（w/w）混合，在400～4000 cm-1范圍內(nèi)以4 cm-1分辨率進(jìn)行掃描。利用蛋白質(zhì)的酰胺I區(qū)（1600～1700 cm-1）定量分析β-折疊、α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量。使用Omnic和Peakfit v4.12軟件進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)的平均值。采用Microsoft Excel 2010計(jì)算整理數(shù)據(jù)，Origin10.0進(jìn)行作圖，SPSS13.0軟件（SPSS公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性分析采用LSD檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種小麥粉和面筋蛋白的總蛋白含量

10個(gè)品種小麥粉和面筋蛋白的總蛋白含量如圖1所示。不同品種小麥粉總蛋白含量有差異，其值介于8.20%～13.95%之間，與張艷[14]報(bào)道的61個(gè)不同品種小麥粉總蛋白含量接近（面粉蛋白質(zhì)含量變幅為10.70%～16.19%）。10種小麥粉中，豫保1號(hào)和鄭麥103兩個(gè)品種小麥粉屬于低筋粉、師欒02-1和新麥26兩個(gè)品種小麥粉屬于高筋粉、其余六個(gè)品種小麥粉屬于中筋粉；其中，鄭麥103小麥粉的總蛋白含量最低，師欒02-1小麥粉的總蛋白含量最高（圖1）。

圖 1 不同品種小麥粉和面筋蛋白的總蛋白含量Fig.1 Crude protein content of flour and gluten from different wheat cultivars

不同品種小麥面筋蛋白的總蛋白含量較高，盡管鄭麥103小麥面筋蛋白的總蛋白含量最低（其值為77.92%），但仍高于文獻(xiàn)[15-16]使用的面筋蛋白總蛋白含量。李翠翠等[15]研究亞硫酸鈉對(duì)小麥面筋蛋白的影響時(shí)使用的面筋蛋白的粗蛋白含量為77.68%。臧艷妮等[16]以粗蛋白含量為76.25%的小麥面筋蛋白為試驗(yàn)材料，考察了超聲波和糖基化復(fù)合改性對(duì)面筋蛋白性質(zhì)的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)室制備的面筋蛋白可用于后續(xù)的功能特性測(cè)定。

2.2 不同品種小麥面筋蛋白的持水性和持油性

蛋白在吸水充足、離心后結(jié)合保留水的能力，被稱為蛋白持水性。持水性是面筋蛋白用于焙烤食品的一個(gè)重要的參數(shù)，可影響面筋網(wǎng)絡(luò)的形成。持油性是指蛋白質(zhì)的非極性側(cè)鏈結(jié)合游離脂肪酸的能力，可影響食品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味[17]。蛋白質(zhì)的制備方法、蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均能影響蛋白的持油性[18]。

面筋蛋白的持水性和持油性在不同品種小麥間存在差異（圖2）。高筋小麥面筋蛋白持水性顯著高于低筋和中筋小麥面筋蛋白，低筋小麥中的鄭麥103面筋蛋白樣品持水性最低（P＜0.05），僅為175.95%；高筋小麥中的新麥26面筋蛋白持水性最高（P＜0.05），為356.58%。本文所考察的面筋蛋白持水性的數(shù)值與文獻(xiàn)報(bào)道相近。Schopf等[19]報(bào)道了39種商品用面筋蛋白的持水性范圍為117.4%～190.3%，Kaushik等[20]研究發(fā)現(xiàn)4種不同面筋蛋白的持水性范圍為249.94%～354.22%。

圖 2 不同品種小麥面筋蛋白的持水性和持油性Fig.2 Water and oil holding capacity of gluten from different wheat cultivars

高筋小麥面筋蛋白的持油性明顯高于低筋和高筋小麥面筋蛋白，中筋小麥面筋蛋白的持油性相對(duì)較高。持油性最差的是鄭麥103面筋蛋白樣品，為275.90%；師欒02-1面筋蛋白樣品的持油性最強(qiáng)，其值為392.05%（圖2）。本文所考察面筋蛋白持油性高于Schopf等[19]的研究結(jié)果（持油性數(shù)值為98.5%～129.1%），而與Kaushik等[20]報(bào)道的結(jié)果類似，其值在246.19%～356.00%之間。這可能與面筋蛋白的來(lái)源、持油性的測(cè)定方法不同有關(guān)[19]。

2.3 不同品種小麥面筋蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

面筋蛋白分子既含有親水基團(tuán)，也含有疏水基團(tuán)，從而使得面筋蛋白具有表面活性。在劇烈攪拌時(shí)，面筋蛋白能夠形成泡沫。不同品種小麥面筋蛋白的起泡性不同，隨著筋力的增加，起泡性呈下降趨勢(shì)；豫保1號(hào)面筋蛋白的起泡性（該值為183.33%）顯著高于其它面筋蛋白（P＜0.05）；師欒02-1面筋蛋白樣品的起泡性最差，僅為101.67%（圖3）。高筋小麥面筋蛋白具有較高的泡沫穩(wěn)定性，其中師欒02-1面筋蛋白樣品的泡沫穩(wěn)定性最好，其值高達(dá)97.54%；而低筋小麥面筋蛋白的泡沫穩(wěn)定性較弱，鄭麥103面筋蛋白樣品的泡沫穩(wěn)定性最差，其值僅為64.70%（圖3）。

圖 3 不同品種小麥面筋蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig.3 Foaming ability and foaming stability of gluten from different wheat cultivars

2.4 不同品種小麥面筋蛋白的乳化活性

蛋白質(zhì)的乳化性是指蛋白質(zhì)能使油與水形成穩(wěn)定的乳化液的能力。乳化性可受分子結(jié)構(gòu)、溶解性、表面張力等影響[21]。試驗(yàn)范圍內(nèi)的10個(gè)品種小麥面筋蛋白的乳化活性普遍較低，且都低于1 m2/g。高筋小麥面筋蛋白的乳化活性較強(qiáng)，其中師欒02-1面筋蛋白樣品乳化活性最大，其值為0.68 m2/g；部分中筋小麥面筋蛋白的乳化性較低，其中周麥18Ⅱ面筋蛋白樣品的乳化活性最低，僅為0.12 m2/g。此外，低筋小麥中的豫保1號(hào)面筋蛋白樣品乳化活性較高，其值高達(dá)0.47 m2/g（圖4）。小麥蛋白的乳化活性與面制品的柔軟度有關(guān)，乳化活性越大，其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，對(duì)其制品的口感能夠產(chǎn)生一定影響[22]。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)加工制品需要選擇適宜的面筋蛋白。

2.5 不同品種小麥面筋蛋白的表面疏水性

表面疏水性是對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)數(shù)量、三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種反映，也是衡量分子間相互作用強(qiáng)弱的重要參數(shù)[23]。表面疏水性對(duì)極性條件下的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象中起著重要作用，能從側(cè)面反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[24,25]。低筋小麥面筋蛋白的表面疏水性顯著高于中筋和高筋小麥面筋蛋白（P＜0.05），中筋小麥的表面疏水性最低。中筋小麥面筋蛋白表面疏水性普遍偏低，百農(nóng)307、百農(nóng)207和百農(nóng)4199小麥面筋蛋白樣品的表面疏水性差異不顯著（P＞0.05）。低筋小麥中的鄭麥103面筋蛋白樣品表面疏水性最高（P＜0.05），其值為44.81 μg；中筋小麥中的百農(nóng)418面筋蛋白樣品表面疏水性最低（P＜0.05），其值僅為15.28 μg（圖5）。這與楊月月[1]研究結(jié)果類似，不同面筋含量小麥面筋蛋白的表面疏水性隨小麥筋力的增大呈先下降后上升趨勢(shì)，中筋小麥粉面筋蛋白的表面疏水性最低。

圖 4 不同品種小麥面筋蛋白的乳化性Fig.4 Emulsifying capacity of gluten from different wheat cultivars

圖 5 不同品種小麥面筋蛋白的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of gluten from different wheat cultivars

2.6 不同品種小麥面筋蛋白的游離巰基和二硫鍵

巰基在維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)方面作用重大[18]，其數(shù)目和分散情況能夠影響面筋蛋白的存在狀態(tài)，與面團(tuán)的品質(zhì)有密切關(guān)系[1]。二硫鍵的含量與面制品品質(zhì)呈顯著正相關(guān)[26]。不同品種小麥面筋蛋白的游離巰基和二硫鍵含量見圖6。低筋小麥的面筋蛋白游離巰基含量遠(yuǎn)高于中筋和高筋小麥。低筋小麥中的豫保1號(hào)面筋蛋白樣品游離巰基含量最高，其值為4.61 μmol/g；高筋小麥中的師欒02-1面筋蛋白樣品游離巰基含量最低，僅為2.90 μmol/g（圖6）。王娜[27]研究發(fā)現(xiàn)，高筋粉蛋白質(zhì)中的游離巰基含量顯著（P＜0.05）低于低筋和高筋粉，低筋粉蛋白質(zhì)中的游離巰基最高，與本文研究結(jié)果類似。不同品種小麥面筋蛋白的二硫鍵含量不同，高筋小麥面筋蛋白的二硫鍵含量顯著（P＜0.05）高于中筋和低筋小麥，其中師欒02-1面筋蛋白樣品二硫鍵含量高達(dá)43.78 μmol/g，而豫保1號(hào)面筋蛋白樣品的二硫鍵含量?jī)H為27.56 μmol/g（圖7）。王娜[27]研究表明，高筋面粉蛋白中的二硫鍵含量顯著（P＜0.05）高于低筋和中筋面粉，低筋面粉蛋白中二硫鍵含量最低，與本文研究結(jié)果類似。含較高游離巰基的面筋蛋白具有較高的表面疏水性（圖5），這可能與游離巰基含量較高時(shí)，蛋白分子的解折疊程度大，更多的疏水性殘基暴露于蛋白分子表面，進(jìn)而引起表面疏水性增大有關(guān)[28]。

圖 6 不同品種小麥面筋蛋白的游離巰基含量Fig.6 Free sulfhydryl group content of gluten from different wheat cultivars

2.7 不同品種小麥面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)直接影響維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵、二硫鍵、疏水鍵等作用力，進(jìn)而影響面筋蛋白的硬度、彈性、黏性等功能性質(zhì)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)可利用紅外光譜進(jìn)行分析，各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量分析結(jié)果見表1。參試樣品中面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊比例均最高，可以看出不同品種小麥面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，這與黃蓮艷等[29]的研究結(jié)果一致。高筋小麥面筋蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)比例最高，其次是中筋小麥，低筋小麥的最低；新麥26面筋蛋白樣品的α-螺旋比例高達(dá)25.07%（P＜0.05），而豫保1號(hào)面筋蛋白樣品的α-螺旋比例僅為19.78%（P＜0.05）。高筋小麥面筋蛋白具有較低的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比例，而低筋小麥面筋蛋白具有高的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比例（P＜0.05）。此外，高筋與部分中筋小麥面筋蛋白β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例差別不大。楊月月[1]、王娜[27]研究顯示的不同筋力小麥粉面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)各比例的變化趨勢(shì)與本文研究結(jié)果類似。含較低比例α-螺旋結(jié)構(gòu)和較高比例無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的面筋蛋白具有較高的表面疏水性（圖5）。當(dāng)?shù)鞍追肿又笑?螺旋含量低和無(wú)規(guī)卷曲含量高時(shí)，蛋白分子的無(wú)序性增加，分子結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，分子結(jié)構(gòu)展開，埋藏在分子內(nèi)部的疏水性殘基更多的暴露在分子表面，使得表面疏水性較高[28]。

表1 不同品種面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 1 Secondary structure in gluten from different wheat cultivars

圖 7 不同品種小麥面筋蛋白的二硫鍵含量Fig.7 Disulfide bond content of gluten from different wheat cultivars

3 結(jié)論

不同品種小麥面筋蛋白各功能特性間存在差異。面筋蛋白的持水性、持油性分布范圍分別為175.95%～356.58%、275.90%～392.05%。面筋蛋白的起泡性隨小麥筋力的上升而下降，而表面疏水性隨筋力的上升先下降后上升。面筋蛋白的游離巰基、二硫鍵含量及二級(jí)結(jié)構(gòu)在不同品種間亦存在區(qū)別。低筋小麥面筋蛋白含有較高的游離巰基，而其二硫鍵含量和α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例均較低；高筋小麥面筋蛋白含有較低的游離巰基和較高比例的α-螺旋結(jié)構(gòu)。此外，研究顯示，具有較低α-螺旋結(jié)構(gòu)比例和較高的游離巰基含量的低筋小麥面筋蛋白擁有較強(qiáng)的表面疏水性。不同性質(zhì)的面筋蛋白可滿足不同的食品加工需求。人們可根據(jù)具體領(lǐng)域的應(yīng)用需要，選擇不同品種的面筋蛋白。