胡珍，吳庭，孫弦，劉睿

皮膚黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）是來源于黑色素細胞的皮膚惡性腫瘤，發(fā)病隱匿且易轉(zhuǎn)移，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，給人類健康帶來嚴重威脅［1］。目前，CMM的主要治療手段是手術、放化療等。順鉑（DDP）是一線化療藥物，抗腫瘤作用已被廣泛認可，但由于黑色素細胞易形成耐藥性，極大地影響了CMM的治療效果及DDP的應用［2-3］。因此，深入探討CMM化療耐藥相關基因及其分子調(diào)控相關機制，對尋找新型CMM化療耐藥分子靶點有較大意義。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一種反義RNA分子，不具有蛋白編碼能力，能與靶基因非編碼區(qū)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達而發(fā)揮促癌或抑癌作用［4］。變異性漿細胞瘤異位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）是lncRNAs家族一員，既往研究顯示，其在CMM病人癌組織中異常高表達，且體外研究表明抑制其表達后能顯著抑制CMM細胞活性，促進細胞凋亡［5］。抑制PVT1可顯著抑制結(jié)直腸癌耐藥細胞株LoVo/DDP的增殖，增加其化療敏感性［6］。微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是一類非編碼RNA，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、表達，參與多種生理活動［7］。miR-214-3p作為常見的miRNA，被證實參與調(diào)控癌細胞活性［8］，PVT1在乳腺癌組織中特異性高表達，降低miR-214的表達可增加乳腺癌細胞化療耐藥性。研究顯示，過表達miR-214-3p可顯著抑制肺癌細胞存活能力及多藥耐藥性［9］。目前，有關PVT1、miR-214-3p對CMM細胞DDP耐藥性的影響及相關機制研究鮮有報道，因此本研究于2020年3—9月探討PVT1與miR-214-3p對CMM耐藥細胞生物學行為的影響，以期為臨床尋找新型CMM化療耐藥分子靶點提高化療效果提供一定參考。

1 材料與方法

1.1材料人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1細胞株（BNCC100491）購自北納創(chuàng)聯(lián)（北京）生物技術研究院。RPMI培養(yǎng)基（3-2001）、蛋白提取試劑盒（BC3711-50T）、轉(zhuǎn)染試劑盒（LipofectamineTM3000，EF010-E）購自美國艾美捷；3-2（4，5-二甲基噻唑-2）-2-四甲基偶氮噻唑藍（MTT）（CS2905）、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（WK304）、核酸分離試劑（Trizol Reagent，YT526）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（KFS303-HUV）購自北京百奧萊博；兔抗人凋亡抑制蛋白X（XIAP）（201477-T36）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）（ATA25287）、細胞增殖相關核抗原Ki-67（100130-MM21）、B細 胞 淋巴 瘤-2（Bcl-2）（FT-B3598S）、β肌動蛋白（β-actin）（ABP57456）一抗、辣根過氧化物酶（HRP）（羊抗兔，SE12-0.1）二抗均購自武漢益普生物；注射用順鉑（凍干型）（貨號C14330-100mg，規(guī)格10 mg）購自山東齊魯制藥。PVT1-inhibitor及miR-214-3p-inhibitor購自上海吉瑪。BBD6220培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher Scien‐tific；ELx800酶標儀、C1000定量PCR儀購自美國Bio-rad；CytoFLEX流式細胞儀購自美國Beckman。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 細胞株解凍后復蘇，加入含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（5%二氧化碳，37℃，飽和濕度），每2～3天換液，傳代培養(yǎng)，利用DDP濃度梯度法建立DDP耐藥細胞株SK-MEL-1/DDP細胞，以5.33 mg/L DDP溶液維持細胞耐藥性，在正式實驗前1周更換不含DDP的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2細胞分組及處理 取對數(shù)生長期細胞株重懸，接種于24孔板（2.5×105個/孔），分為四組。（1）空白對照組（NG組）：只含SK-MEL-1/DDP細胞，用含10%滅活胎牛血清+90%RPMI培液培養(yǎng)48 h；（2）陰性轉(zhuǎn)染組（NC組）：加入5μL LipofectamineTM3000和50μmol/L PVT1-inhibitor-NC，用含10%滅活胎牛血清+90%RPMI培液培養(yǎng)48 h；（3）抑制PVT1表達組（PVT1-inhibitor組）：加入5μL LipofectamineTM3000和50μmol/L PVT1-inhibitor序列，用含10%滅活胎牛血清+90%RPMI培液培養(yǎng)48 h；（4）共轉(zhuǎn)染組（PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組）：加入5 μL LipofectamineTM3000和50μmol/L PVT1-inhibitor及miR-214-3p-inhibitor序列共轉(zhuǎn)染后，用含10%滅活胎牛血清+90%RPMI培液培養(yǎng)48 h。嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，收集各組細胞用于后續(xù)實驗。PVT1-inhibitor序列：5′-ACTTTAAGTGGAG‐GCTGAATCATCT-3′，miR-214-3p-inhibitor序 列：5′-ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3′。

1.2.3實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測lncRNA PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平 TRIzol法提取培養(yǎng)48 h的細胞株總RNA，測定濃度。按照試劑盒說明書方法逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（cDNA）。引物由蘇州泓迅生物設計合成。2?ΔΔCt方法計算PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平相對表達量。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖能力及耐藥性 取轉(zhuǎn)染48 h后的細胞株接種于24孔板（2.5×104個/孔），每組6個復孔。細胞增殖能力檢測：各組細胞均繼續(xù)培養(yǎng)48 h后向各孔加入MTT 20μL，加入150μL二甲基亞砜振蕩。在酶標儀490 nm處測定各孔細胞光密度。計算細胞增殖抑制率（%）=（1?實驗組光密度值/對照組光密度值）×100%。耐藥性檢測：各組細胞分別加入0、2、4、8、16、32、64μg/L DDP溶液［10］，100毫升/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其余操作同細胞增殖能力測定方法。計算細胞增殖抑制率且用線性回歸法計算藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 取轉(zhuǎn)染48 h后的細胞株接種于24孔板（2.5×105個/孔），按照試劑盒說明書處理細胞，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后離心棄上清，PBS混勻沉淀，70%乙醇4℃固定24h。PBS清洗，加5μL PI+5μL AnnexinV‐FITC混勻，染色30 min、稀釋后上機檢測。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達 裂解細胞并提取總蛋白，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，以脫脂牛奶（5%）封閉，加入一抗Ki-67、Bcl-2、Bax、XIAP（1∶500），4℃過夜，清洗，加入二抗（1∶1 000）孵育1 h。顯色、成像。分析蛋白含量。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測PVT1對miR-214-3p的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 TargetScan預測PVT1與miR-214-3p存在結(jié)合位點，擴增序列后構(gòu)建含miR-214-3p結(jié)合位點的PVT1基因克隆載體，構(gòu)建PVT1野生型質(zhì)粒（PVT1-WT）和突變型質(zhì)粒（PVT1-MT）。將PVT1-WT、PVT1-MT分別與miR-214-3p-inhibitor-NC、miR-214-3p-inhibitor共轉(zhuǎn)染于SK-MEL-1/DDP細胞，分別為miR-214-3p-inhibitor-NC-PVT1-WT組、miR-214-3p-inhibitor-PVT1-WT組、miR-214-3p-inhibitor-NCPVT1-MT組、miR-214-3p-inhibitor-PVT1-MT組，具體轉(zhuǎn)染步驟按“1.2.2”中進行；培養(yǎng)48 h后按照試劑盒方法，檢測熒光素酶相對活性。

1.3統(tǒng)計學方法軟件SPSS19.0分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1各組SK-MEL-1/DDP細胞PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平比較與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組SK-MEL-1/DDP細胞PVT1、XIAP mRNA水平顯著降低（P<0.05），miR-214-3p顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-inhibi‐tor+miR-214-3p-inhibitor組SK-MEL-1/DDP細胞PVT1水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），miR-214-3p水平顯著降低（P<0.05），XIAPmRNA水平顯著升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平比較/±s

表2 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平比較/±s

注：PVT1為變異性漿細胞瘤異位1，β-actin為β-肌動蛋白，XIAP為人凋亡抑制蛋白X。①與NG組比較，P<0.05。②與NC組比較，P<0.05。③與PVT1-inhibitor組比較，P<0.05。

組別NG組NC組PVT1-inhibitor組PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組F值P值重復次數(shù)6 6 6 6 PVT1/β-actin 0.99±0.15 1.00±0.15 0.55±0.08①②0.53±0.07①②29.45<0.001 miR-214-3p/U6 1.02±0.15 1.01±0.16 1.45±0.21①②1.20±0.18①②③8.18<0.001 XIAPmRNA 1.00±0.15 1.02±0.15 0.53±0.08①②0.85±0.13①②③18.02<0.001

2.2各組SK-MEL-1/DDP細胞增殖情況比較NG組［（0.00±0.00）%］、NC組［（0.08±0.01）%］、PVT1-in‐hibitor組［（22.87±3.43）%］及PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組［（15.12±2.27）%］SK-MEL-1/DDP細胞增殖抑制率比較，F(xiàn)=184.10，P<0.001；與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-inhibitor+miR-214-3pinhibitor組顯著降低（P<0.05）。

表1 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）引物序列

2.3各組SK-MEL-1/DDP細胞對DDP耐藥性比較NG組［（45.03±1.35）μg/L］、NC組［（47.81±1.33）μg/L］、PVT1-inhibitor組［（15.13±0.45）μg/L］及PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組［（23.98±0.72）μg/L］SK-MEL-1/DDP細胞IC50比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=1 418.74，P<0.001）；與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組顯著降低（P<0.05）；與PVT1-in‐hibitor組比較，PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組顯著升高（P<0.05）。

2.4各組SK-MEL-1/DDP細胞凋亡情況比較NG組［（15.69±2.35）%］、NC組［（17.01±2.55）%］、PVT1-inhibitor組［（40.05±6.06）%］及PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組［（27.88±4.19）%］SK-MEL-1/DDP細胞凋亡率比較，F(xiàn)=46.48，P<0.001；與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibi‐tor組顯著降低（P<0.05）。

2.5各組SK-MEL-1/DDP細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組SK-MEL-1/DDP細胞Ki-67、Bcl-2蛋白顯著降低（P<0.05），Bax顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組SKMEL-1/DDP細胞Ki-67、Bcl-2蛋白顯著升高（P<0.05），Bax顯著降低（P<0.05）。見圖1，表3。

表3 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較/±s

表3 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較/±s

注：Ki-67為細胞增殖相關核抗原，Bax為Bcl-2相關X蛋白，β-actin為β-肌動蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2。①與NG組比較，P<0.05。②與NC組比較，P<0.05。③與PVT1-inhibitor組比較，P<0.05。

組別NG組NC組PVT1-inhibitor組PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組F值P值重復次數(shù)6 6 6 6 Ki-67/β-actin 1.18±0.18 1.20±0.19 0.57±0.09①②0.85±0.13①②③23.08<0.001 Bax/β-actin 0.33±0.04 0.35±0.05 0.97±0.16①②0.67±0.11①②③52.75<0.001 Bcl-2/β-actin 0.95±0.14 0.96±0.15 0.30±0.05①②0.71±0.11①②③40.44<0.001

圖1 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較

2.6雙熒光素酶報告基因檢測miR-214-3p對PVT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Targetscan（http：//www.tar‐getscan.org/）預測結(jié)果顯示，PVT1與miR-214-3p基因序列存在結(jié)合位點，見圖2。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PVT1 WT的實驗中，miR-214-3pinhibitor-PVT1-WT組熒光素酶活性（1.37±0.21）顯著高 于miR-214-3p-inhibitor-NC-PVT1-WT組（1.03±0.15）（t=3.23，P=0.009）。

圖2 miR-214-3p與變異性漿細胞瘤異位1（PVT1）基因靶向關系

NG組（0.38±0.06）、NC（0.35±0.05）、PVT1-inhib‐itor組（1.15±0.17）及PVT1-inhibitor+miR-214-3p-in‐hibitor組（0.80±0.12）PVT1蛋白表達比較，F(xiàn)=70.25，P<0.001；與NG組、NC比較，PVT1-inhibitor組顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-in‐hibitor+miR-214-3p-inhibitor組顯著降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞XIAP蛋白表達比較

3 討論

CMM是具有較強侵襲及轉(zhuǎn)移能力的皮膚惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率高［11］。目前CMM病人主要以化療作為術后輔助治療手段，DDP是臨床常用一線化療藥，其半衰期短，需持續(xù)給藥以維持藥物有效濃度，使得腫瘤細胞易產(chǎn)生原發(fā)或繼發(fā)耐藥性，以致化療效果極不理想［12］。因此研究CMM生物治療靶標增強DDP耐藥細胞敏感性，已成為臨床研究熱點。

lncRNA為一種非編碼RNA，在基因水平調(diào)控、細胞分化和發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用，其表達異?？蓪е掳┌Y發(fā)生［13］。Chen等［14］研究顯示，抑制PVT1表達可顯著抑制黑色素瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等，可能成為黑色素瘤潛在治療靶點。Wang等［15］研究顯示，PVT1在耐DDP的口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中表達上調(diào)，增加癌細胞順鉑耐藥性。目前認為化療是通過多種途徑介導腫瘤細胞凋亡來殺死癌細胞［16］。ki-67蛋白是細胞增殖相關基因蛋白，在癌變組織中呈高表達，Bcl-2是一種原癌基因，能抑制細胞凋亡，Bax是人體主要的促凋亡基因［17］。本研究以SK-MEL-1/DDP細胞為研究對象，成功轉(zhuǎn)染后，結(jié)果顯示，與NG組、NC組比較，PVT1-inhibi‐tor組SK-MEL-1/DDP細胞PVT1水平、Ki-67、Bcl-2蛋白表達均顯著降低，細胞增殖抑制率、凋亡率、miR-214-3p及Bax表達均顯著升高。說明抑制PVT1表達可能通過上調(diào)miR-214-3p表達抑制SKMEL-1/DDP細胞增殖并誘導細胞凋亡。與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組SK-MEL-1/DDP細胞IC50顯著降低。與既往腫瘤相關研究［18］中表達模式一致，提示抑制PVT1表達可能提高SK-MEL-1/DDP細胞對DDP的化療敏感性。miR-214-3p是長度為20-23個核苷酸的單鏈RNA分子，是基因表達的重要調(diào)節(jié)劑，能夠介導腫瘤發(fā)生［19］。Chen等［20］研究顯示，過表達PVT1可靶向下調(diào)miR-214表達促進卵巢癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移。XIAP是凋亡抑制基因家族成員之一，能夠拮抗多種凋亡誘導因素，抑制細胞凋亡［21］。蔡松濤等［22］研究顯示，過表達微小RNA-23b-3p可靶向下調(diào)XIAP表達抑制類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖并促進其凋亡。Yang等［23］研究顯示，過表達miR-214-3p可靶向下調(diào)XIAP表達促進視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞凋亡以降低細胞對多種化學藥物敏感性。本研究預測到PVT1與miR-214-3p存在結(jié)合位點，且進一步證實，miR-214-3p-inhibitor-PVT1-WT組熒光素酶活性顯著高于miR-214-3p-inhibitor-NC-PVT1-WT組，與NG組、NC組比較，PVT1-inhibi‐tor組SK-MEL-1/DDP細胞miR-214-3p水平顯著升高、XIAP mRNA及其蛋白表達顯著降低；當轉(zhuǎn)染miR-214-3p-inhibitor后，發(fā)現(xiàn)下調(diào)PVT1表達抑制SK-MEL-1/DDP細胞增殖并促進細胞凋亡能力顯著降低，細胞IC50明顯回升，且miR-214-3p水平顯著降低、XIAPmRNA和蛋白表達顯著升高。說明下調(diào)PVT1表達提高SK-MEL-1/DDP細胞對DDP的化療敏感性，可能是通過靶向上調(diào)miR-214-3p，抑制XIAP表達實現(xiàn)的。

綜上所述，過表達PVT1可能通過靶向下調(diào)miR-214-3p表達，進而上調(diào)XIAP表達降低SK-MEL-1/DDP細胞對DDP的化療敏感性。CMM發(fā)生及耐藥機制復雜，關于PVT1與miR-214-3p/XIAP軸在SK-MEL-1/DDP細胞化療耐藥中的具體作用機制仍需深入探索。