陳敬君，馬賢聰，楊泉，趙雯，王日升

腦卒中是一種急性腦血管疾病，病死率和致殘率較高，是由于血流不能流入大腦而引起的腦組織受損的一種疾病，常與腦部血管阻塞有關(guān)，腦部缺血后，腦組織中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6等炎性因子大量釋放，引起神經(jīng)突起的縮短、損傷甚至斷裂，導(dǎo)致突觸聯(lián)系及神經(jīng)聯(lián)系減少，最終引發(fā)神經(jīng)功能損傷，因此病人常有口眼歪斜、半身不遂、神志迷茫等不良表現(xiàn)，嚴重影響病人的生活質(zhì)量及生命安全［1-2］。芍藥苷是提取于芍藥科植物芍藥干燥根中的活性成分，為單萜糖苷類中藥單體，具有抗炎、神經(jīng)保護、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，Zhang等［3］研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可改善血管性癡呆大鼠的局部腦血流量并抑制腦組織中TNFα、IL-6等炎性因子的釋放，Zhang等［4］研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可顯著降低腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評分，對大鼠神經(jīng)細胞具有一定的保護作用，并認為其可能是通過上調(diào)磷酸化環(huán)磷酸腺苷（cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）等蛋白發(fā)揮作用。cAMP是cAMP/蛋白激酶A（PKA）/CREB通路的重要組成部分，近年來的研究表明該通路與缺血性腦損傷聯(lián)系密切，激活該通路對于腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用［5-6］，因此，本研究自2019年12月至2020年12月，在前人研究的基礎(chǔ)上探究芍藥苷調(diào)控cAMP/PKA/CREB通路對腦卒中大鼠的影響，為臨床治療腦卒中提供新思路。

1 材料與方法

1.1動物SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，平均體質(zhì)量約225 g，6～8周齡，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0002。動物房溫度25℃左右，相對濕度50%左右，實驗期間自由進食、飲水，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。在實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2主要試劑及儀器芍藥苷、H89（PKA抑制劑）（編號T2230、T11524）購于陶素生化；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、高效RIPA組織裂解液、BCA蛋白測定試劑盒（貨號：G1120、SEKR-0009、SEKR-0005、SEKR-0003、SEKR-0002、R0010、PC0020）購于北京索萊寶科技有限公司；兔源cAMP、PKA、CREB、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（貨號ab76238、ab32390、ab32515、ab8245、ab6721）購 于Abcam。酶標儀（型號AMR-100）購于杭州奧盛儀器有限公司；組織切片機（型號MA752）購于英國Campden公司；自動組織脫水機（型號HY-1050）購于浙江金華惠友儀器；凝膠成像儀（型號SmartGel 6000）購于北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；光學(xué)顯微鏡（型號DMD108）購于德國徠卡。

1.3方法

1.3.1動物模型制備及分組給藥 腦卒中大鼠模型的制備參考文獻［7］并稍作改動，40只SD大鼠，分為假手術(shù)組（8只）和造模組（32只），將大鼠麻醉后持仰臥位固定，頸部備皮并做常規(guī)消毒，于頸部正中行切口，鈍性分離大鼠頸部肌肉，暴露左側(cè)頸外動脈、頸內(nèi)動脈主干及分支，結(jié)扎頸外動脈及近心端頸總動脈，將頸總動脈結(jié)扎處遠端3 mm處剪開并插入直徑為0.28 mm的線栓，由頸內(nèi)動脈插入約20mm，到達左側(cè)大腦中動脈分支處，造成局灶性腦缺血后結(jié)扎頸內(nèi)動脈，隨后逐層縫合切口，假手術(shù)組大鼠僅分離動脈，不做結(jié)扎處理。待大鼠蘇醒后進行Zea Longa神經(jīng)功能缺損評分［8］，無神經(jīng)功能損傷癥狀記為0分，對側(cè)前爪無法充分伸展記為1分，行走時向兩側(cè)旋轉(zhuǎn)記為2分，行走時向兩側(cè)傾倒記為3分，意識喪失、無法行走記為4分；0分認為動脈未阻塞，4分認為模型構(gòu)建失敗，1～3分認為腦卒中模型構(gòu)建成功。實驗過程中若出現(xiàn)不符合標準的現(xiàn)象，及時選取備用大鼠進行造模。

將模型構(gòu)建成功的大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、芍藥苷組、H89組（PKA抑制劑）、芍藥苷+H89組，每組8只。芍藥苷組灌胃30 mg/kg芍藥苷［9］，H89組腹腔注射1 mg/kg H89［10］，芍藥苷+H89組灌胃芍藥苷后腹腔注射H89，持續(xù)給藥2周，模型組、假手術(shù)組以生理鹽水代替。

1.3.2大鼠神經(jīng)功能缺損評分及記憶行為學(xué)評估分別在給藥第1、7、14天根據(jù)Zea Longa評分法對各組大鼠進行［8］神經(jīng)功能缺損評分，評分標準同“1.3.1”。

大鼠記憶行為學(xué)評估采用Morris水迷宮實驗測定，將水池分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，將直徑為6 cm的圓形平臺置于第Ⅰ象限中央（低于水面2 cm），前4天進行定向巡航實驗：將大鼠從第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限區(qū)域投入水中，記錄其爬上平臺所需要的時間，記為潛伏期，潛伏期越小表明大鼠學(xué)習(xí)能力越好，若120 s內(nèi)大鼠仍未找到平臺，指引其爬上平臺并停留20 s，此時潛伏期記為120 s。第5天進行空間探索試驗：將平臺撤去，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿越平臺位置的次數(shù)，次數(shù)越多表明大鼠記憶能力越強。

1.3.3大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β水平檢測 將大鼠麻醉后腹主動脈取血，室溫靜置20 min后，4℃、1 000g離心10 min，分離血清，采用TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1βELISA試劑盒進行測定，具體步驟參考相關(guān)試劑盒要求。

1.3.4大鼠腦組織獲取及HE染色 將大鼠麻醉后處死，剪開大鼠頭部皮膚，切開肌肉、骨膜后鈍性分離顱骨，取大鼠腦組織，一部分用于HE染色觀察，一部分用于測定cAMP/PKA/CREB通路相關(guān)蛋白的表達。

取適量大鼠腦組織，在4%的多聚甲醛中固定48 h，將固定好的大鼠腦組織用生物組織脫水機進行脫水及透明處理，將腦組織浸入石蠟中制成包埋有腦組織的蠟塊，冷卻凝固后將其切成約4μm厚的切片，將切片貼附在載玻片上，用二甲苯溶液脫蠟、梯度乙醇水化、蒸餾水洗、蘇木素染色、分化液分化、返藍液返藍、二甲苯透明、中型樹膠封片，在顯微鏡下觀察并分析。具體操作方法參考HE染色試劑盒的要求。

1.3.5大鼠腦組織cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達檢測 取大鼠腦組織適量，用眼科剪剪碎，加入高效RIPA組織裂解液（1 mg∶10μL），用組織勻漿機進行勻漿處理，將勻漿后的樣品離心取上清液，根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒的要求測定其中蛋白含量，將各組蛋白濃度調(diào)至相同并加熱變性，冷卻后取20μL進行電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將所有蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，將纖維膜用5%的脫脂奶粉溶液進行封閉約2 h，根據(jù)分子量將目的蛋白截取下來置于孵育盒中，加入cAMP、PKA、CREB、p-CREB、GAP‐DH一抗（1∶1 000），4℃冰箱中孵育過夜后用洗膜緩沖液漂洗3次，加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h后用洗膜緩沖液漂洗3次，經(jīng)過顯色、定影后于凝膠成像儀中觀察并分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS22.0軟件對實驗中的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計并分析。定量數(shù)據(jù)采用±s的方式進行描述，采用單因素方差分析對多組間進行比較，采用重復(fù)測量方差分析進行多時間點觀測資料的比較，采用LSD法進一步進行多組間的兩兩比較。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（給藥第1天、第7天、第14天）（P<0.05）；與模型組相比，芍藥苷組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低（給藥第7天、第14天）（P<0.05）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+H89組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（給藥第7天、第14天）（P<0.05）；與H89組相比，芍藥苷+H89組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低（給藥第7天、第14天）（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較/（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較/（分，±s）

注：①與同時間點假手術(shù)組比較，P<0.05。②與同時間點模型組比較，P<0.05。③與同時間點芍藥苷組比較，P<0.05。④與同時間點H89組比較，P<0.05。⑤與同組給藥第1天比較，P<0.05。⑥與同組給藥第7天比較，P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組芍藥苷組H89組芍藥苷+H89組組間F，P值時間F，P值交互F，P值鼠數(shù)8 8 8 8 8給藥第1天0.05±0.01 2.69±0.56①2.58±0.53①2.65±0.62①2.60±0.52①27.56，<0.001 141.74，<0.001 10.02，<0.001給藥第7天0.10±0.02 2.26±0.43①1.24±0.25①②⑤2.90±0.58①②③1.86±0.43①②③④⑤給藥第14天0.03±0.01 2.25±0.46①0.72±0.14①②⑤⑥2.93±0.68①②③1.05±0.38①②③④⑤⑥

2.2各組大鼠記憶行為學(xué)評估與假手術(shù)組相比，模型組大鼠潛伏期顯著升高（P<0.05），穿臺次數(shù)［（15.20±2.08）次比（8.70±1.79）次］顯著減少（P<0.05）；與模型組相比，芍藥苷組大鼠潛伏期顯著降低（P<0.05），穿臺次數(shù)［（8.70±1.79）次比（13.06±1.86）次］顯著升高（P<0.05）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+H89組大鼠潛伏期顯著升高（P<0.05），穿臺次數(shù)［（13.06±1.86）次比（11.08±1.64）次］顯著減少（P<0.05）；與H89組相比，芍藥苷+H89組大鼠潛伏期顯著 降 低（P<0.05），穿 臺 次 數(shù)［（6.30±1.33）次 比（11.08±1.64）次］顯著升高（P<0.05）。其中潛伏期數(shù)據(jù)見表2。

表2 各組大鼠記憶行為學(xué)評估中的潛伏期比較/（s，±s）

表2 各組大鼠記憶行為學(xué)評估中的潛伏期比較/（s，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。③與芍藥苷組比較，P<0.05。④與H89組比較，P<0.05。⑤與第1天相比，P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組芍藥苷組H89組芍藥苷+H89組組間F，P值時間F，P值交互F，P值鼠數(shù)8 8 8 8 8第1天35.28±5.35 81.73±11.09①48.61±6.66①②96.53±15.25①②③66.08±9.65①②③④180.73，<0.001 2.77，0.044 0.08，1.000第2天36.71±6.73 80.26±11.75①45.22±6.36①②94.72±14.25①②③64.30±9.35①②③④第3天34.50±6.33 77.59±10.78①44.30±6.20①②92.01±15.07①②③62.18±9.12①②③④第4天32.54±6.07 74.44±11.06①40.16±6.13①②⑤90.06±14.71①②③60.60±8.94①②③④

2.3各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β水平比較與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β水平顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，芍藥苷組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β水平顯著降低（P<0.05）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+H89組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β水平顯著升高（P<0.05）；與H89組相比，芍藥苷+H89組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β水平顯著降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β水平比較/（ng/L，±s）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β水平比較/（ng/L，±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白細胞介素-6，IL-2為白細胞介素-2，IL-1β為白細胞介素-1β。①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。③與芍藥苷組比較，P<0.05。④與H89組比較，P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組芍藥苷組H89組芍藥苷+H89組F值P值鼠數(shù)8 8 8 8 8 TNF-α 75.32±5.69 120.13±10.07①86.25±7.85①②132.68±11.14①②③106.19±9.45①②③④54.43<0.001 IL-6 40.41±5.41 64.86±9.56①47.12±6.75①②77.33±13.22①②③55.13±8.07①②③④20.96<0.001 IL-2 33.13±5.90 58.86±10.12①40.20±7.11①②71.66±12.58①②③48.68±8.12①②③④22.54<0.001 IL-1β 5.01±1.04 12.19±1.54①6.46±1.44①②15.28±2.58①②③8.12±1.24①②③④52.41<0.001

2.4各組大鼠腦組織病理學(xué)觀察假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)緊密，神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織損傷嚴重，神經(jīng)細胞排列紊亂，細胞體積增大，出現(xiàn)細胞核偏移、空泡化等現(xiàn)象；與模型組相比，芍藥苷組大鼠腦組織受損得到緩解；與芍藥苷組相比，芍藥苷+H89組大鼠腦組織受損較重；與H89組相比，芍藥苷+H89組大鼠腦組織受損得到緩解。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)觀察（HE染色×200）：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為芍藥苷組；D為H89組；E為芍藥苷+H89組

2.5各組大鼠腦組織cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達比較與假手術(shù)組相比，模型組大鼠cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，芍藥苷組大鼠cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+H89組大鼠cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與H89組相比，芍藥苷+H89組大鼠cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達顯著升高（P<0.05）。見表4，圖2。

表4 各組大鼠腦組織cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達比較/±s

表4 各組大鼠腦組織cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達比較/±s

注：cAMP為環(huán)磷酸腺苷，PKA為蛋白激酶A，CREB為環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，p-CREB為磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白。①與假手術(shù)組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。③與芍藥苷組比較，P<0.05。④與H89組比較，P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組芍藥苷組H89組芍藥苷+H89組F值P值鼠數(shù)8 8 8 8 8 cAMP/GAPDH 1.03±0.23 0.31±0.05①0.79±0.20①②0.26±0.03①②③0.60±0.13①②③④37.16<0.001 PKA/GAPDH 1.05±0.24 0.30±0.06①0.75±0.19①②0.20±0.05①②③0.53±0.12①②③④41.52<0.001 p-CREB/CREB 1.02±0.23 0.29±0.08①0.77±0.23①②0.18±0.06①②③0.55±0.14①②③④34.94<0.001

圖2 各組大鼠腦組織cAMP/PKA/CREB通路蛋白表達情況

3 討論

腦卒中又稱中風(fēng)，是位于癌癥、心臟病之后的第三大死因，是許多國家成人殘疾的主要原因，主要有缺血性腦卒中和出血性腦卒中。其中缺血性腦卒中發(fā)病率占80%以上，腦中動脈閉塞是缺血性腦卒中常見的病因，具有較高的病死率和致殘率，偏癱是腦卒中病人幸存者常見的不良癥狀，嚴重影響病人的心理健康及生活質(zhì)量［11-12］。多項研究表明腦部缺血后，機體會釋放大量炎性因子并激活小膠質(zhì)細胞，激活的小膠質(zhì)細胞可與浸潤的白細胞結(jié)合產(chǎn)生更多的炎性介質(zhì)，從而引起腦組織水腫、神經(jīng)元凋亡、血腦屏障破壞等，最終導(dǎo)致腦神經(jīng)功能受損［12-13］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的神經(jīng)缺損評分及血清炎性因子顯著升高，大鼠記憶行為學(xué)能力顯著下降，腦神經(jīng)細胞受損嚴重，提示急性腦缺血可導(dǎo)致大鼠機體炎癥反應(yīng)加劇，引發(fā)神經(jīng)突起的斷裂、損傷，進而影響神經(jīng)、突觸之間的聯(lián)系，導(dǎo)致腦部神經(jīng)功能受損，最終出現(xiàn)認知功能障礙、神經(jīng)功能缺損等表現(xiàn)，表明腦卒中大鼠模型構(gòu)建成功。

芍藥苷是芍藥根中的主要活性成分，是一種水溶性糖苷，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物學(xué)功能，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病等的臨床治療及基礎(chǔ)研究［14-15］。Wu等［16］研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可減輕急性腦梗死大鼠的腦損傷并提高大鼠的神經(jīng)狀況，對腦缺血表現(xiàn)出一定的保護作用。Gu等［17］研究結(jié)果顯示芍藥苷可顯著改善阿爾茨海默病小鼠的認知功能，降低小鼠機體炎癥反應(yīng)，對腦神經(jīng)具有一定的保護作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過芍藥苷治療的腦卒中大鼠的神經(jīng)功能缺損評分及血清炎性因子顯著降低，記憶行為學(xué)能力顯著提高，腦組織受損得到緩解，提示芍藥苷可顯著抑制腦卒中大鼠機體炎癥反應(yīng)，有效發(fā)揮神經(jīng)保護功能。

近年來的研究表明，cAMP/PKA/CREB通路與腦缺血疾病聯(lián)系密切，當細胞受到缺血、缺氧等刺激時，可催化ATP脫去一個焦磷酸形成cAMP，cAMP可進一步激活PKA，促使亞基PKAc進入細胞核，從而促進CREB磷酸化形成p-CREB，從而激活cAMP/PKA/CREB通路，該通路的激活對于腦缺血造成的神經(jīng)損傷、軸突再生、神經(jīng)元保護具有積極作 用［18-19］。Jiang等［20］研 究 發(fā) 現(xiàn) 激 活cAMP/PKA/CREB通路可促進腦卒中大鼠行為恢復(fù)并發(fā)揮神經(jīng)保護作用，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過芍藥苷治療的腦卒中大鼠腦組織中cAMP、PKA、p-CREB蛋白表達顯著高于模型組，提示芍藥苷可能激活cAMP/PKA/CREB通路緩解大鼠腦組織受損情況。H89為PKA抑制劑，可顯著抑制PKA表達，從而阻斷該通路的激活，本研究結(jié)果顯示，芍藥苷+H89組大鼠腦組織中cAMP、PKA、p-CREB蛋白表達顯著顯著低于芍藥苷組，進一步提示芍藥苷緩解腦卒中的作用可能與激活cAMP/PKA/CREB通路有關(guān)。

綜上所述，芍藥苷可顯著改善腦卒中大鼠的神經(jīng)功能及機體炎癥反應(yīng)，對大鼠腦組織具有一定的保護作用，可能是通過激活cAMP/PKA/CREB通路發(fā)揮作用，但本研究未設(shè)置相應(yīng)的通路激活劑進行對比實驗，因此仍須深入研究。