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        四重逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速聯(lián)檢四種難鑒別蚊媒病毒的效果觀察

        2022-06-11 09:33:06韓明月林源吉吳新新魏晨星董學(xué)妍王曉明萬海同余道軍
        浙江醫(yī)學(xué) 2022年10期
        關(guān)鍵詞:體系檢測(cè)

        韓明月 林源吉 吳新新 魏晨星 董學(xué)妍 王曉明 萬海同 余道軍

        蚊蟲是地球上對(duì)人類健康危害最為嚴(yán)重的動(dòng)物之一,作為疾病的傳播媒介可引起多種蚊媒傳染病[1]。流行于亞洲、非洲及南美洲地區(qū)的登革熱[2]、寨卡、基孔肯雅熱、黃熱病[3]等蚊媒傳染病在我國亦時(shí)有發(fā)生,這4種典型蚊媒傳染病臨床癥狀相似,均可表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉疼痛、厭食、乏力等[4],給臨床診斷和鑒別診斷帶來一定困難。因此對(duì)蚊媒傳染病中登革病毒(dengue fever virus,DENV)、黃熱病毒(yellow fever virus,YFV)、基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)4種臨床難鑒定病原體進(jìn)行快速聯(lián)合檢測(cè)及鑒別診斷意義重大。近年來,除了傳統(tǒng)的診斷方法,如血清學(xué)、病毒分離培養(yǎng)等外,分子生物學(xué)方法在病毒性疾病的診斷中得到了廣泛應(yīng)用,常見的分子生物學(xué)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、核酸分子雜交、DNA測(cè)序、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等,近年來等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因其簡(jiǎn)便、快速、精確、低成本的優(yōu)勢(shì),在分子生物學(xué)診斷技術(shù)中越來越重要[5-10],重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)技術(shù)是一種建立較晚的等溫?cái)U(kuò)增方法,被認(rèn)為是一種可以替代PCR的技術(shù)[11-12]。目前,基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)同時(shí)檢測(cè)多種蚊媒病毒的研究報(bào)道較為少見[13-14]。本研究以登革熱、黃熱病、基孔肯雅熱、寨卡的病原體為研究對(duì)象,基于RPA技術(shù)實(shí)現(xiàn)4種典型輸入性蚊媒病毒聯(lián)合檢測(cè)[15-17],建立針對(duì)DENV、YFV、CHIKV、ZIKV的四重逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(quadruple reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA)檢測(cè)方法,旨在加快檢測(cè)速度,提高檢測(cè)靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

        1 材料和方法

        1.1 樣本、儀器和試劑 本研究使用的臨床血清樣本均由杭州市疾病預(yù)防控制中心提供,包含DENV-1型5例、DENV-2型 5例、DENV-3型5例、DENV-5型5例,所有標(biāo)本均由杭州市疾病預(yù)防控制中心確認(rèn)為DENV陽性。含有DENV、YFV、CHIKV和ZIKV靶基因的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品和體外合成RNA樣本由杭州邦唯生物科技有限公司合成。ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào):7500)購自美國 ABI公司,TwistAmp Liquid Exo Kit(批號(hào):153689)購自英國TwistDX公司,WarmStart RTx(批號(hào):M0380L)購自美國NEB公司。所有引物和探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(批準(zhǔn)文號(hào):KY-20211105-0083-01)。

        1.2 方法

        1.2.1 引物及探針設(shè)計(jì) 在NCBI上檢索DENV、YFV、CHIKV、ZIKV的基因序列,應(yīng)用Clustalw軟件對(duì)所有序列比對(duì)分析,選取各自同源性高的保守序列,根據(jù)TwistAmpRDNA Amplification Kits Assay Design Manual進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì),作為待檢靶基因特異性核酸序列的引物和探針,登錄NCBI通過BLAST程序比對(duì)分析,每種病毒設(shè)計(jì)3對(duì)不同的引物和相應(yīng)的特異探針,見表1。

        表1 引物和探針序列

        1.2.2 單重RT-RPA體系建立及引物篩選 50 μl RT-RPA 反應(yīng)體系包括:2×反應(yīng)緩沖液 25 μl,dNTPs 5 μl,10×Probe E-mix 5 μl,正向引物 F(10 μmol/L)2.1 μl,反向引物 R(10 μmol/L)2.1 μl,探針(10 μmol/L)0.6 μl,20× Core Reaction Mix 2.5 μl,50×Exo(每個(gè)反應(yīng))1 μl,WarmStart RTx 1 μl(當(dāng)模板為RNA時(shí)加入),MgOAc(280 mmol/L)2.5μl,模板1 μl(質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA或體外合成RNA),ddH2O補(bǔ)至50 μl。反應(yīng)條件:40 ℃,30 min。采用上述建立的反應(yīng)體系對(duì)DENV、YFV、CHIKV及ZIKV的引物進(jìn)行篩選,DENV、YFV及ZIKV的引物有9種不同的排列組合方式,CHIKV的引物有6種不同的排列組合方式(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示R1不適用),根據(jù)熒光信號(hào)和擴(kuò)增曲線的變化確定最合適的引物組合。

        1.2.3 四重RT-RPA體系的建立 在上述建立的RT-RPA體系基礎(chǔ)上建立四重RT-RPA體系,通過正交設(shè)計(jì)對(duì)四重RT-RPA體系進(jìn)行了優(yōu)化,包括引物濃度、反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix濃度和 50×Exo濃度、10×Probe E-mix濃度、探針濃度、模板濃度,每個(gè)因素設(shè)置高低不同的4個(gè)水平,所有因素分成3組進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果及熒光信號(hào)和擴(kuò)增曲線的變化確定最佳反應(yīng)條件和最合適的反應(yīng)體系(WarmStart RTx按照試劑說明書加入1 μl后,四重RT-RPA熒光信號(hào)強(qiáng)、擴(kuò)增曲線良好,故WarmStart RTx用量未做優(yōu)化)。

        1.2.4 單重及四重RT-RPA的特異度、靈敏度試驗(yàn)將已知拷貝數(shù)的含DENV、YFV、CHIKV、ZIKV目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋至濃度在 1×101~1×108Copies/ml作為單重RT-RPA 的模板;將 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA按1∶1∶1∶1混合后進(jìn)行10倍倍比稀釋成 1×101~1×108Copies/ml,作為四重 RT-RPA的模板。取不同載量的模板1 μl(質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA),用滅菌注射用水做對(duì)照實(shí)驗(yàn),按照上述確立的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件對(duì)各稀釋度模板進(jìn)行單重及四重RT-RPA檢測(cè),所有檢測(cè)標(biāo)本至少檢測(cè)3次,確定該方法的檢測(cè)靈敏度。同時(shí)應(yīng)用上述建立的4種病毒各自的單重及四重反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,以臨床巨細(xì)胞病毒、EB病毒、HBV、丙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒核酸及DENV、YFV、CHIKV、ZIKV病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA為模板,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照,對(duì)上述建立的單重及四重RTRPA反應(yīng)體系的特異度進(jìn)行驗(yàn)證。

        1.2.5 四重RT-RPA的重復(fù)性試驗(yàn) 將已知拷貝數(shù)的DENV、YFV、CHIKV、ZIKV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合液或體外合成RNA混合液(1×105Copies/ml)平均分成10份,-20℃冷凍保存作為模板,按上述實(shí)驗(yàn)建立的四重RT-RPA反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增,最后分析檢測(cè)結(jié)果[閾值時(shí)間(threshold time,TT)]的重復(fù)性,以變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)表示[19]。

        1.2.6 臨床標(biāo)本驗(yàn)證 取經(jīng)RT-PCR確認(rèn)的臨床確診登革熱患者的20份血清樣本和30份陰性血清樣本,使用單重RT-RPA及四重RT-RPA方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),并與臨床實(shí)驗(yàn)室在用的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的檢測(cè)結(jié)果相比較,進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的可靠性。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用方差分析計(jì)算反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果;計(jì)算單重RT-RPA和四重RT-RPA與RT-PCR法的診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值(positive predictive value,PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(negative predictive value,NPV)。

        2 結(jié)果

        2.1 引物篩選結(jié)果 根據(jù)單重RT-RPA的擴(kuò)增曲線,DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的最佳引物組合分別為:DENV-F2/DENV-R1,YFV-F2/YFV-R3,CHIKV-F2/CHIKV-R3和 ZIKV-F2/ZIKV-R1。

        2.2 四重RT-RPA反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

        2.2.1 引物加入量的優(yōu)化結(jié)果 DENV引物加入量的不同對(duì)四重RT-RPA擴(kuò)增結(jié)果的影響不同(FDENV=9.976,P<0.05),而 YFV、CHIKV、ZIKV 引物加入量的不同對(duì)四重RT-RPA擴(kuò)增結(jié)果的影響不明顯(FYFV=0.431、FCHIKV=0.416、FZIKV=1.644,均 P >0.05)。

        2.2.2 反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix及50×Exo加入量的優(yōu)化結(jié)果 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV不同反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix 及 50×Exo加入量對(duì)四重RT-RPA擴(kuò)增結(jié)果TT值的影響不同(FDENV=4.883、FYFV=6.873、FCHIKV=20.746、FZIKV=15.293,均P<0.05)。

        2.2.3 核酸模板量、10×Probe E-mix加入量及探針濃度的優(yōu)化結(jié)果 核酸模板量、10×Probe E-mix加入量、探針濃度對(duì)四重RT-RPA擴(kuò)增結(jié)果TT的影響不明顯(F=1.083、3.453、1.191,均 P >0.05)。

        2.2.4 確定四重RT-RPA反應(yīng)體系 結(jié)合2.2.1至2.2.3的結(jié)果,確定最終的60 μl的四重RT-RPA反應(yīng)體系:2×反應(yīng)緩沖液 25 μl,dNTPs 4.8 μl,10× Probe E-mix 5 μl,正向引物 F(10 μmol/L)2.1 μl,反向引物R(10 μmol/L)2.1 μl,探針(10 μmol/L)0.6 μl,20×Core Reaction Mix 2.5 μl,50×Exo 1.5 μl,WarmStart RTx 1 μl(當(dāng)模板為 RNA 時(shí)加入),MgOAc(280 mmol/L)3.0 μl,模板 1 μl,ddH2O 補(bǔ)至 60 μl;反應(yīng)條件:42 ℃,30 min。

        2.3 單重及四重RT-RPA的特異度 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV之間以及與其他多種常見病毒之間不存在交叉反應(yīng),只有DENV、YFV、CHIKV和ZIKV產(chǎn)生了陽性擴(kuò)增曲線,且擴(kuò)增曲線較為平滑。巨細(xì)胞病毒、EB病毒、HBV、丙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒等均未產(chǎn)生陽性擴(kuò)增曲線,呈陰性反應(yīng),見圖1-2。

        圖1 單重RT-RPA特異性試驗(yàn)圖

        圖2 四重RT-RPA特異性試驗(yàn)圖(a、b、c、d分別為四重RT-RPA僅加入DENV、YFV、CHIKV、ZIKV中的一種時(shí)的特異性試驗(yàn)圖;e為四重RT-RPA同時(shí)加入DENV、YFV、CHIKV、ZIKV時(shí)的特異性試驗(yàn)圖)

        2.4 單重及四重RT-RPA的靈敏度 RT-RPA對(duì)DENV、ZIKV、CHIKV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限分別為 1×102、1×102、1×102Copies/ml,對(duì)YFV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限<1×102Copies/ml,對(duì) DENV、YFV、CHIKV 和 ZIKV 體外合成 RNA 的檢出限分別為 1×102、1×102、1×102、1×102Copies/ml,見圖 3-4;四重RT-RPA對(duì)DENV、YFV、CHIKV和ZIKV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限分別為1×102、1×102、1×102、1×102Copies/ml,對(duì)體外合成 RNA 標(biāo)本的檢出限分別為 5×102、5×102、5×102、5×102Copies/ml,見圖5-6。

        圖3 單重RT-RPA檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度試驗(yàn)

        圖4 單重RT-RPA檢測(cè)體外轉(zhuǎn)錄RNA靈敏度試驗(yàn)

        圖5 四重RT-RPA檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度試驗(yàn)

        圖6 四重RT-RPA檢測(cè)體外轉(zhuǎn)錄RNA靈敏度試驗(yàn)

        2.5 四重RT-RPA的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果 RT-RPA法TT值的CV為1.76%~5.96%,見表2。

        表2 四重RT-RPA的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

        2.6 臨床標(biāo)本驗(yàn)證結(jié)果 50份血清樣本中,RT-PCR及單重RT-RPA法將20份DENV陽性樣本全部檢出,陽性標(biāo)本檢出率均為100.00%,四重RT-RPA檢測(cè)DENV陽性19份,陽性標(biāo)本檢出率為95.00%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,單重RT-RPA、四重RT-RPA、RT-PCR對(duì)DENV檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

        表3 DENV臨床標(biāo)本不同檢測(cè)方法的靈敏度、特異度、PPV和NPV比較

        3 討論

        本研究開發(fā)了一種四重RT-RPA方法,該方法在單個(gè)反應(yīng)中包含4對(duì)引物和相應(yīng)的探針,用于單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)4種蚊媒病毒,通過對(duì)DENV、YFV、CHIKV和ZIKV基因的檢索及序列比對(duì),選擇相對(duì)保守的區(qū)域進(jìn)行了引物和探針的設(shè)計(jì),為了獲得最佳的擴(kuò)增效果,本研究中使用的引物長(zhǎng)度均為32~34 bp,并通過對(duì)不同引物組合方式的篩選實(shí)驗(yàn)為每種病毒選擇了最佳的引物組合。

        本研究采用正交設(shè)計(jì)對(duì)反應(yīng)體系(包括反應(yīng)溫度、Mg2+濃度和50×Exo加入量等)進(jìn)行了優(yōu)化。合適的反應(yīng)溫度是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一,RPA技術(shù)的推薦反應(yīng)溫度為37~42℃,以往的研究表明,RPA可以在15~50℃進(jìn)行[20]。較高的反應(yīng)溫度可以避免非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生,因此對(duì)于四重RT-RPA,較高的反應(yīng)溫度更適合,于是本研究在38、40、42℃進(jìn)行了四重RT-RPA,并最終確定四重RT-RPA的最佳反應(yīng)溫度為42℃。Mg2+可以與dNTPs和核酸骨架相互作用,影響聚合酶分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的活性,因此Mg2+的濃度對(duì)擴(kuò)增效率有很大影響,Mg2+濃度過高會(huì)降低擴(kuò)增的特異度,Mg2+濃度過低會(huì)影響擴(kuò)增的產(chǎn)物獲得率。同樣,單重及四重RT-RPA反應(yīng)中也需要加入Mg2+,且Mg2+加入后RT-RPA反應(yīng)立即開始,經(jīng)過上述的正交實(shí)驗(yàn),單重RT-RPA中加入MgOAc 14 mmol/L或四重RT-RPA中加入16.8 mmol/L時(shí),反應(yīng)結(jié)果最佳。在單重及四重RT-RPA反應(yīng)體系中,逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)擴(kuò)增效率較為關(guān)鍵,因此,本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21-22],選擇逆轉(zhuǎn)錄效果較好的WarmStart RTx作為逆轉(zhuǎn)錄酶,研究結(jié)果表明,該酶逆轉(zhuǎn)錄效果好,在實(shí)際說明書推薦的用量(1 μl)情況下即能滿足實(shí)驗(yàn)要求,故未對(duì)該酶用量進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

        本研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的單重RT-RPA方法和四重RT-RPA方法具有較高的靈敏度、特異度和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)表明,該單重及四重RT-RPA法不與其他常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng),且可以在背景核酸存在的情況下擴(kuò)增靶核酸,但背景核酸的存在對(duì)擴(kuò)增的靈敏度有一定的影響,背景核酸濃度越高,檢測(cè)的靈敏度越低。研究表明,RPA反應(yīng)體系中所用引物、探針和靶序列的選擇會(huì)影響其自身對(duì)背景核酸的耐受性[23]。在該四重RTRPA體系中,共有4對(duì)引物和4個(gè)探針,引物之間可以形成二聚體,但由于本研究中使用了探針法,二聚體的形成對(duì)擴(kuò)增信號(hào)沒有顯著影響,但引物和探針數(shù)量的增加可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)或競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增,影響部分引物的擴(kuò)增效率,本研究結(jié)果也表明引物探針用量對(duì)四重RT-RPA影響不明顯,但在四重RT-RPA中,背景核酸的存在對(duì)擴(kuò)增的靈敏度產(chǎn)生了一定影響,從而導(dǎo)致四重RT-RPA的靈敏度略低于單重RT-RPA。

        本研究建立的針對(duì)DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的單重RT-RPA和四重RT-RPA檢測(cè)方法雖然具有良好的特異度、靈敏度和重復(fù)性。但也存在一定的不足,目前的工作仍然需要昂貴的實(shí)時(shí)熒光PCR儀器,因此本研究建立的檢測(cè)方法目前尚不適合資源貧乏的地區(qū),筆者團(tuán)隊(duì)正在嘗試開發(fā)一種更便攜的小型檢測(cè)系統(tǒng)來滿足這些要求。此外,由于引物之間的相互干擾以及背景核酸的存在,四重RT-RPA的檢測(cè)靈敏度尚不理想。同時(shí),由于目前傳染病防控良好,臨床標(biāo)本不足,本研究?jī)H驗(yàn)證了登革熱臨床血清標(biāo)本,尚缺乏YFV、CHIKV和ZIKV的臨床標(biāo)本,只能以體外合成的RNA樣本作為替代物來檢驗(yàn)已建立的單重及四重RT-RPA的臨床應(yīng)用價(jià)值。雖然本研究存在以上的不足,但四重反應(yīng)體系的應(yīng)用前景是不可否認(rèn)的,本研究可為其他新發(fā)再發(fā)傳染病快速診斷及鑒別診斷方法的建立提供一定的方向。

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