別蓓蓓 周亞明 嚴(yán)成俊 孫晉

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最常見的原發(fā)性肝臟腫瘤，發(fā)病率位居惡性腫瘤第6位，死亡率更是高居惡性腫瘤第4位[1-2]。盡管近年來在HCC診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，尤其是分子靶向治療和免疫治療[3]，但由于病情隱匿且治療后極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者的預(yù)后較差、死亡率居高不下，因此迫切需要開發(fā)可用于HCC診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物以及新型治療分子靶標(biāo)。假基因是指基因組中與正常蛋白編碼基因序列相似，但缺乏編碼氨基酸能力的DNA拷貝[4]。過去一直認(rèn)為假基因無生物學(xué)功能，但近年來發(fā)現(xiàn)假基因可在RNA水平發(fā)揮調(diào)控作用，參與生物個體發(fā)育和疾病發(fā)生、發(fā)展[5-6]。Han等[7]發(fā)現(xiàn)大量假基因在不同腫瘤亞型之間存在差異表達(dá)，可對腫瘤組織學(xué)亞型進(jìn)行準(zhǔn)確分類且與患者生存期顯著相關(guān)，提示假基因具有可作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物的潛力。小核糖核蛋白多肽E假基因2（small nuclear ribonucleoprotein polypeptide E pseudogene 2,SNRPEP2）位于人類9號染色體，轉(zhuǎn)錄本長度為279 bp。研究發(fā)現(xiàn)SNRPEP2在結(jié)腸癌和乳腺癌中表達(dá)上調(diào)且與不良預(yù)后相關(guān)[8-9]。目前，SNRPEP2在HCC中表達(dá)是否異常以及是否參與HCC發(fā)生、發(fā)展仍不清楚。本研究基于癌癥基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫探討SNRPEP2在HCC組織中的表達(dá)及其臨床意義，以期為SNRPEP2應(yīng)用于HCC診斷和預(yù)后判斷等轉(zhuǎn)化研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及處理 從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載374例HCC組織樣本和50例癌旁正常組織樣本的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床資料。將下載的FPKM格式的RNA-seq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM格式，經(jīng)log2轉(zhuǎn)化處理后即可用于后續(xù)分析。

1.2 SNRPEP2在HCC組織中的表達(dá)及與臨床特征的關(guān)系分析 采用R語言ggplot2程序包分析HCC組織和癌旁正常組織中SNRPEP2的表達(dá)情況；根據(jù)表達(dá)量中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用二分類logistic回歸模型分析SNRPEP2表達(dá)水平與性別、年齡、TNM分期、病理分期、腫瘤狀態(tài)（包括無瘤和荷瘤兩種狀態(tài)，無瘤指通過各種手段去除腫瘤組織后使肉眼或影像學(xué)不可見腫瘤組織，荷瘤指有影像學(xué)或肉眼可見的腫瘤組織）、組織學(xué)分級、血清甲胎蛋白（alpha fetal protein,AFP）水平、血管浸潤情況、肝纖維化Ishak評分、鄰近肝組織炎癥情況、Child-Pugh分級等臨床特征的關(guān)系。

1.3 SNRPEP2與HCC患者預(yù)后的關(guān)系 通過R語言survival程序包分析SNRPEP2表達(dá)與總生存期（overall survival,OS）、疾病特異性生存期（disease specific survival,DSS）和無進(jìn)展間隔期（progress free interval,PFI）的關(guān)系，并運(yùn)用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響預(yù)后的危險因素，其中單因素分析結(jié)果P值＜0.1的臨床指標(biāo)進(jìn)一步納入多因素分析。根據(jù)影響預(yù)后的危險因素采用R語言rms程序包進(jìn)一步構(gòu)建Nomogram預(yù)測模型，用于預(yù)測HCC患者1、3和5年生存率。

1.4 SNRPEP2對HCC的診斷效能分析 利用R語言pROC程序包制作ROC曲線，通過AUC評估SNRPEP2在HCC診斷中的效能。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。SNRPEP2在非配對和配對組織中的表達(dá)差異分別采用兩獨(dú)立樣本t檢驗和配對樣本t檢驗。繪制Kaplan-Meier生存曲線并通過log-rank檢驗分析SNRPEP2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。通過建立二分類logistic回歸模型分析SNRPEP表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。通過單因素和多因素Cox回歸分析臨床病理特征與患者OS的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNRPEP2在HCC組織中的表達(dá)情況 通過比較374例HCC組織和50例癌旁正常組織中SNRPEP2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)HCC組織中SNRPEP2表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01，見圖1a；進(jìn)一步比較50例HCC組織和癌旁配對組織中SNRPEP2表達(dá)水平，結(jié)果顯示HCC組織中SNRPEP2表達(dá)水平明顯高于癌旁配對組織（P＜0.01），見圖1b。以上結(jié)果提示，SNRPEP2在HCC組織中表達(dá)上調(diào)。

圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析SNRPEP2在HCC組織中的表達(dá)情況（a：HCC組織與癌旁正常組織中SNRPEP2表達(dá)情況比較；b：HCC組織和癌旁配對組織中SNRPEP2表達(dá)情況比較）

2.2 SNRPEP2表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系 通過構(gòu)建二分類logistic回歸模型對374例HCC患者的SNRPEP2表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SNRPEP2高表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級（OR=2.539，P＜0.01）、血清 AFP水平（OR=2.966，P＜0.01）、血管浸潤（OR=1.658，P＜0.05）和鄰近肝組織炎癥（OR=1.703，P＜0.05）均有關(guān)，而與性別、年齡、T分期、N分期、M分期、病理分期、腫瘤狀態(tài)、肝纖維化Ishak評分和Child-Pugh分級均無關(guān)（均P＞0.05），見表 1。

表1 SNRPEP2表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 SNRPEP2表達(dá)水平與HCC患者預(yù)后的關(guān)系SNRPEP2高表達(dá)患者OS、DSS和PFI均低于低表達(dá)患者（均P＜0.05），提示SNRPEP2高表達(dá)與HCC的不良預(yù)后有關(guān)，見圖2。

圖2 SNRPEP2高表達(dá)與低表達(dá)HCC患者生存曲線的比較

單因素Cox回歸分析結(jié)果提示，T分期（HR=2.598，P＜0.01）、M 分期（HR=4.077，P＜0.05）、病理分期（HR=2.504，P＜0.01）、腫瘤狀態(tài)（HR=2.317，P＜0.01）和SNRPEP2表達(dá)水平（HR=2.024，P＜0.01）均是影響HCC患者OS的危險因素；進(jìn)一步多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤狀態(tài)（HR=1.816，P＜0.05）和 SNRPEP2表達(dá)水平（HR=1.970，P＜0.01）均是影響 HCC患者 OS的獨(dú)立危險因素，見表2。

表2 影響HCC患者總生存期的單因素和多因素回歸分析

續(xù)表2

此外，綜合T分期、M分期、病理分期、腫瘤狀態(tài)和SNRPEP2表達(dá)水平等影響預(yù)后的危險因素進(jìn)一步構(gòu)建Nomogram預(yù)測模型，用于預(yù)測HCC患者1、3和5年生存率，從Nomogram圖可以看出，病理分期、腫瘤狀態(tài)和SNRPEP2表達(dá)水平對HCC患者的生存貢獻(xiàn)較大，見圖3。

圖3 預(yù)測HCC患者1、3和5年總生存率的Nomogram圖

2.4 SNRPEP2表達(dá)水平對HCC的診斷效能 ROC曲線分析顯示，SNRPEP2表達(dá)水平對于診斷HCC（AUC=0.925）、T1期（AUC=0.913）、M0期（AUC=0.936）、病理分期I期（AUC=0.911）均具有良好的效能。此外，SNRPEP2表達(dá)水平對于評估1、3和5年OS（AUC分別為0.659、0.649 和 0.635）、DSS（AUC 分別為 0.672、0.643 和0.604）和 PFI（AUC 分別為 0.615、0.515 和 0.610）同樣具有較好的效能，見圖4。

圖4 SNRPEP2表達(dá)水平診斷HCC及評估預(yù)后的ROC曲線

3 討論

越來越多的研究證明，假基因是基因組進(jìn)化過程中形成的“分子化石”，其可以通過在DNA、RNA及蛋白等層面行使調(diào)控作用，進(jìn)而在各種生理和病理過程中發(fā)揮生物學(xué)功能，特別是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[10-11]。

近年來，假基因在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制也得到了證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)一些假基因在HCC中表達(dá)異常且與患者的不良預(yù)后相關(guān)，其可通過調(diào)控HCC增殖、遷移、侵襲、血管生成等生物學(xué)過程進(jìn)而發(fā)揮促癌或抑癌作用。例如，重組人膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）的假基因ANXA2P1在HCC中表達(dá)上調(diào)，與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，其可通過miR-376a-3p/ANXA2調(diào)控軸促進(jìn)HCC的增殖、遷移和侵襲[12]。假基因泛素結(jié)合酶E2C假基因3（UBE2CP3）被發(fā)現(xiàn)其在HCC中高表達(dá)且與不良預(yù)后呈正相關(guān)，其可通過激活ERK1/2/HIF-1α/血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）信號增強(qiáng)HCC細(xì)胞VEGFA的分泌進(jìn)而促進(jìn)血管生成[13]。此外，研究發(fā)現(xiàn)磷酸酶與張力蛋白同源物（PTEN）的假基因PTENP1在HCC中發(fā)揮抑癌作用，其在HCC中呈現(xiàn)低表達(dá)，其過表達(dá)可通過失活PI3K/Akt信號通路進(jìn)而抑制HCC的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬[14]。

位于人類9號染色體p24.1區(qū)域的SNRPEP2，為SNRPE基因的加工型假基因。研究發(fā)現(xiàn)SNRPEP2在結(jié)腸癌和乳腺癌中表達(dá)上調(diào)且與不良預(yù)后相關(guān)[8-9]，但在HCC中的表達(dá)情況及臨床相關(guān)性目前仍不清楚。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫HCC臨床樣本組織的RNA-seq數(shù)據(jù)及其臨床信息進(jìn)行生物信息學(xué)分析，重點(diǎn)圍繞SNRPEP2在HCC中的表達(dá)情況及臨床意義進(jìn)行探討。

首先，基于TCGA數(shù)據(jù)庫HCC組織的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)SNRPEP2在配對和非配對HCC組織中的表達(dá)水平均高于癌旁正常組織，提示SNRPEP2具有作為HCC診斷分子標(biāo)志物的潛力。其次，通過對HCC患者的臨床信息數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘分析，探討了SNRPEP2表達(dá)水平與臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系，SNRPEP2的表達(dá)水平與腫瘤的組織學(xué)分級、血清AFP水平、血管浸潤及鄰近肝組織炎癥均有關(guān)，且SNRPEP2高表達(dá)患者OS、DSS和PFI均低于低表達(dá)患者，是影響HCC患者OS的獨(dú)立危險因素，提示SNRPEP2有望成為HCC診斷和預(yù)后判斷的新型分子標(biāo)志物。此外，通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)SNRPEP2表達(dá)水平對HCC的診斷具有良好的效能，并對患者的OS、DSS和PFI均具有良好的判斷效果，進(jìn)一步表明SNRPEP2可作為HCC診斷、患者預(yù)后判斷和療效評估的新型分子標(biāo)志物的潛力。

綜上所述，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)手段揭示了假基因SNRPEP2在HCC中異常高表達(dá)及其具有作為HCC診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價值，同時為后續(xù)圍繞SNRPEP2開展HCC生物標(biāo)志物相關(guān)研究提供了依據(jù)。由于本研究的SNRPEP2表達(dá)數(shù)據(jù)僅局限于HCC組織，后續(xù)可進(jìn)一步對HCC患者血清/血漿游離或外泌體來源SNRPEP2的表達(dá)及其臨床相關(guān)性和臨床意義進(jìn)行研究。