馮硯平，王 楠，王偉佳△

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.廣東省中山市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528400

急性髓系白血病(AML)是一種基因異質(zhì)性疾病，不同的遺傳特性和分子機制改變致使患者在臨床特征、發(fā)病機制、治療效果及預(yù)后方面存在差異[1]。FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)突變是AML中最常見的基因異常之一，可在25%～30%的新發(fā)AML患者中檢出[2]。以往研究表明，F(xiàn)LT3突變與AML患者的不良預(yù)后有關(guān)，對患者選擇治療方案及評估預(yù)后具有指導(dǎo)價值[3]。但是，F(xiàn)LT3突變陽性的AML患者預(yù)后并不完全一致，因為這些患者往往同時存在其他基因異常，伴隨的異?；蛞苍诩膊√卣髦邪缪葜匾巧?。因此，有必要更加深入地研究FLT3突變陽性AML患者的臨床特征，以及其共存基因突變對疾病治療效果及預(yù)后的影響，為臨床精準(zhǔn)地治療提供依據(jù)。本研究通過收集中山市人民醫(yī)院收治的初診FLT3突變陽性AML患者的臨床資料，綜合分析FLT3突變陽性患者的臨床特點、伴隨突變基因分布及伴隨突變對治療效果和預(yù)后的影響，為細化AML患者風(fēng)險分層及個性化治療方案的制訂提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年8月1日至2020年3月31日中山市人民醫(yī)院血液內(nèi)科收治的初診AML患者，所有患者均通過細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)分型、細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)(以上4項簡稱MICM)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)明確診斷，由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心進行染色體核型、融合基因和AML相關(guān)基因突變檢測。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)MICM確診為AML的初診患者；(2)至少經(jīng)過2個療程的化療，并在每次化療結(jié)束后2周或下一次化療前抽取骨髓評估治療效果；(3)獲得完全緩解(CR)后繼續(xù)進行鞏固治療或選擇造血干細胞移植。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)AML M3型患者；(2)入院前曾在其他醫(yī)院診斷并接受治療的患者；(3)化療達到CR后未繼續(xù)鞏固治療的患者；(4)資料不完善者；(5)失訪患者。本研究共納入AML患者109例，其中男56例、女53例，F(xiàn)LT3突變陽性患者34例、FLT3突變陰性患者75例。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1治療和隨訪 白細胞計數(shù)(WBC)過高的AML患者治療前，首先使用白細胞單采清除術(shù)或服用羥基脲的方法預(yù)處理，去除過多的白細胞。依據(jù)患者的年齡、身體狀況及骨髓增生程度，與患者及其家屬溝通，選擇最合適的化療方案。方案包括：DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)、MA(米托蒽醌+阿糖胞苷)、IA(去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷)、CAGD(粒細胞集落刺激因子+阿糖胞苷+阿克拉霉素+地西他濱)、HAA(高三尖杉酯堿+阿克拉霉素+阿糖胞苷)等。CR患者使用中/大劑量阿糖胞苷或聯(lián)合氟達拉濱、蒽環(huán)類藥物等方案繼續(xù)鞏固治療或進行造血干細胞移植。入組病例的隨訪日期截至2020年8月31日，中位隨訪時間7個月?？偵鏁r間指從患者確診到死亡或隨訪結(jié)束的時間，無病生存時間(DFS)指從患者治療后第1次達到CR至患者復(fù)發(fā)、死亡或隨訪結(jié)束的時間。

1.2.2基因突變檢測、融合基因檢測和染色體核型分析 用EDTA-K2抗凝管留取入組病例的骨髓標(biāo)本，按照說明書操作，使用Ficoll分離液分離骨髓標(biāo)本中的單個核細胞，使用細胞基因組DNA提取試劑盒提取DNA，應(yīng)用一代測序的方法檢測AML常見的30種基因突變；按照Trizol試劑盒的操作說明，提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作要求，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后通過實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)要求，檢測25項融合基因。按24 h培養(yǎng)法常規(guī)檢測染色體，收集有絲分裂中期細胞，常規(guī)制片，按照R顯帶技術(shù)分析10～20個分裂中期細胞，參考《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制》(ISCN2013或2016版)進行異常核型的描述。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；使用Kaplan-Meier法進行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1FLT3突變陽性患者的臨床特點 本研究中FLT3突變陽性患者34例，F(xiàn)LT3突變陰性患者75例。(1)在臨床特征方面：與FLT3突變陰性患者比較，F(xiàn)LT3突變陽性患者在性別，初診血紅蛋白(Hb)水平、血清乳酸脫氫酶(LDH)水平、骨髓原始細胞比例，F(xiàn)AB分型方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；FLT3突變陽性患者的中位年齡明顯大于FLT3突變陰性患者(P<0.05)；與FLT3突變陰性患者相比，F(xiàn)LT3突變陽性患者初診WBC、血小板計數(shù)(PLT)明顯升高(P<0.05)。(2)在細胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)方面：FLT3突變陽性患者中有32.4%伴有染色體核型異常，與FLT3突變陰性患者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；FLT3突變陽性患者融合基因陽性率低于FLT3突變陰性患者(P<0.05)；通過基因突變檢測發(fā)現(xiàn)，44.1%的FLT3突變陽性患者同時伴有NPM1突變，明顯多于FLT3突變陰性患者(P<0.05)；41.2%的FLT3突變陽性患者同時伴有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)突變，明顯多于FLT3突變陰性患者(P<0.05)。(3)在治療效果與預(yù)后方面：化療后，F(xiàn)LT3突變陽性患者1個療程、兩個療程CR率低于FLT3突變陰性患者(P<0.05)；化療結(jié)束后進行隨訪，F(xiàn)LT3突變陽性患者1年總生存(OS)率略低于FLT3突變陰性患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 FLT3突變陽性與FLT3突變陰性AML患者臨床特征比較

圖1 FLT3突變陽性與FLT3突變陰性AML患者的生存曲線

2.2FLT3突變陽性患者伴隨基因突變的分布情況 對34例FLT3突變的AML患者，進行30項AML相關(guān)基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)88.2%(30/34)的患者同時伴有其他類型的基因突變。其中陽性率最高的是NPM1突變，占44.1%(15/34)，其次是DNMT3A突變，占41.2%(14/34)。

2.3NPM1突變對FLT3突變陽性AML患者治療效果及預(yù)后的影響 以是否合并NPM1突變，將FLT3突變陽性患者分為FLT3+/NPM1+組和FLT3+/NPM1-組。將75例FLT3突變陰性患者作為FLT3突變陰性組。從治療效果和預(yù)后方面分析，經(jīng)過1個療程化療后，F(xiàn)LT3+/NPM1+組患者CR率為73.3%，與FLT3突變陰性組的66.7%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但明顯高于FLT3+/NPM1-組患者的21.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；FLT3+/NPM1+組的兩個療程CR率也同樣明顯高于FLT3+/NPM1-組(P<0.05)?；熃Y(jié)束后進行隨訪：FLT3+/NPM1+組患者1年OS率為100.0%；FLT3+/NPM1-組患者1年OS率為50.0%；FLT3突變陰性組患者1年OS率為83.6%。與FLT3+/NPM1-組患者相比，F(xiàn)LT3+/NPM1+組患者的預(yù)后相對更好。見表2、圖2。

表2 FLT3+/NPM1+組、FLT3+/NPM1-組與FLT3突變陰性組患者預(yù)后情況比較[%(n/n)]

圖2 FLT3+/NPM1+、FLT3+/NPM1-與FLT3突變陰性患者的生存曲線

2.4DNMT3A突變對FLT3突變陽性AML患者治療效果及預(yù)后的影響 以是否合并DNMT3A突變，將FLT3突變陽性AML患者分為FLT3+/DNMT3A+組和FLT3+/DNMT3A-組。將75例FLT3突變陰性患者作為FLT3突變陰性組。從治療效果和預(yù)后方面分析，F(xiàn)LT3+/DNMT3A+組患者經(jīng)過1個療程化療后，CR率為50.0%,與FLT3+/DNMT3A-組及FLT3突變陰性組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，3組患者的兩個療程CR率亦差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩個療程化療結(jié)束后進行隨訪：FLT3+/DNMT3A+組1年OS率為42.9%；FLT3+/DNMT3A-組患者1年OS率為77.8%；FLT3突變陰性患者1年OS率為83.6%。與FLT3突變陰性組和FLT3+/DNMT3A-組患者相比，F(xiàn)LT3+/DNMT3A+組患者的1年OS率明顯下降(P<0.05)。FLT3+/DNMT3A+組患者的總生存期明顯縮短(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 FLT3+/DNMT3A+、FLT3+/DNMT3A-與FLT3突變陰性患者預(yù)后情況比較[%(n/n)]

圖3 FLT3+/DNMT3A+、FLT3+/DNMT3A-與FLT3突變陰性患者的生存曲線

3 討 論

AML是一種以造血干細胞和祖細胞的分化阻斷和克隆增殖為特征，以犧牲正常造血功能為代價的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在臨床上具有惡性程度高、異質(zhì)性大的特點[1]。盡管大部分AML患者在經(jīng)過化療后可以達到CR，但卻有相當(dāng)一部分患者無法達到CR而成為難治性AML，并且仍有大量患者在緩解后由于復(fù)發(fā)而出現(xiàn)病情反復(fù)甚至進展，最終導(dǎo)致死亡。隨著對AML研究的不斷深入以及多種實驗技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)AML患者不僅在細胞譜系方面存在差異，在細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的表現(xiàn)也各不相同，這些差異直接影響患者的臨床特征、治療效果及預(yù)后。位于染色體13q12上的FLT3突變是AML中最常見的基因異常之一，具有促進細胞增殖和減少細胞凋亡的作用，25%～30%新診斷的AML患者被檢測出FLT3突變[2]。

本研究對109例初診AML患者的臨床資料進行了分析，結(jié)果表明，有34例患者存在FLT3突變，占31.2%，與DAVER等[2]報道結(jié)果一致。FLT3突變后增加酪氨酸激酶活性，進而導(dǎo)致下游信號通路(如RAS/MAPK、STAT5等)的結(jié)構(gòu)性激活，誘導(dǎo)細胞異常增殖和凋亡受阻[4]。FLT3突變陽性的AML患者經(jīng)常伴有WBC增多及骨髓原始細胞比例高的特點[5]，但也有研究認為，F(xiàn)LT3突變不影響PLT和Hb[6]。在本研究中，F(xiàn)LT3突變陽性AML患者的初診WBC和PLT均明顯高于FLT3突變陰性患者(P<0.05)，而兩組患者初診Hb和骨髓原始細胞比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。有研究指出，F(xiàn)LT3突變多見于FAB分型中的M3型和M5型，在M2型及M6型中突變陽性率較低[7]，而本研究入組的FLT3突變陽性患者中，以M2和M4型多見，共占70.6%。以往一些研究指出，伴有FLT3突變的AML患者易同時伴有其他與白血病相關(guān)的基因異常，其中以NPM1突變多見[8]。在本研究中，有88.2%(30/34)的FLT3突變陽性患者同時伴有其他類型的基因突變，其中檢測到陽性率最高的是NPM1突變，占44.1%(15/34)，其次是DNMT3A突變，占41.2%(14/34)，與FLT3突變陰性患者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，本研究通過對入組患者進行髓系白血病常見融合基因篩查檢測，發(fā)現(xiàn)FLT3突變陽性患者中只有11.8%(4/34)被檢測出融合基因陽性，陽性率明顯低于FLT3突變陰性患者(38.7%，29/75，P<0.05)，提示FLT3突變更常見于融合基因陰性的患者。

FLT3突變陽性AML患者具有總生存期短、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的特點，尤其是在等位基因比例較高的患者中[9]。本研究的患者經(jīng)過兩個療程的標(biāo)準(zhǔn)方案化療后結(jié)果顯示，伴有FLT3突變陽性患者的1個療程CR率及兩個療程CR率均低于FLT3突變陰性的患者(P<0.05)。

NPM1基因編碼在細胞核與細胞質(zhì)之間穿梭的多功能伴侶蛋白，作用于細胞物質(zhì)運輸、細胞分裂、增殖等方面，突變的NPM1蛋白可使PU.1在細胞質(zhì)中移位，從而進一步阻止PU.1與CEBPα/RUNX1的相互作用，并阻斷單核細胞和粒細胞的分化[10]。NPM1突變在AML中十分常見，發(fā)生率為21%～35%[11]。既往研究報道，單純NPM1突變的正常核型AML患者被劃入低風(fēng)險組，是提示預(yù)后良好的因素[12]。FLT3突變常伴有NPM1突變，并可能對患者預(yù)后產(chǎn)生一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3+/NPM1+組患者的1個療程CR率與兩個療程CR率與FLT3陰性組患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但明顯高于FLT3+/NPM1-組(P<0.05)，并且FLT3+/NPM1+組患者的1年OS率也明顯高于FLT3+/NPM1-組患者(P<0.05)，提示當(dāng)NPM1突變存在時，F(xiàn)LT3突變陽性患者的預(yù)后改善。

DNA甲基化、RNA介導(dǎo)的基因沉默和組蛋白修飾等在內(nèi)的表觀遺傳修飾因子失調(diào)與AML發(fā)病有關(guān)[13]。DNMT3A是一種與表觀遺傳修飾相關(guān)的重要蛋白酶[14]，負責(zé)CpG二核苷酸的從頭甲基化。研究結(jié)果表明，DNMT3A突變破壞了甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白亞基的正常連接，對DNMT3A蛋白功能產(chǎn)生顯著的負面影響[15]。DNMT3A突變作為易與FLT3突變同時出現(xiàn)的常見分子學(xué)變異，被許多研究認為與較差的預(yù)后有關(guān)[16]。在本研究中，F(xiàn)LT3+/DNMT3A+組患者化療后1個、兩個療程的CR率與FLT3+/DNMT3A-組及FLT3突變陰性組均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而FLT3+/DNMT3A+組患者的1年OS率及總生存期明顯低于FLT3+/DNMT3A-組和FLT3突變陰性患者(P<0.05)，提示當(dāng)FLT3突變陽性患者同時伴有DNMT3A突變時，預(yù)后明顯變差。

綜上所述，伴有FLT3突變陽性的AML患者常表現(xiàn)為年齡偏大、WBC與PLT升高、CR率低的特點，并常同時存在其他類型的基因突變，其中以NPM1和DNMT3A突變最為多見。不同的伴隨突變會對患者預(yù)后產(chǎn)生一定的影響，應(yīng)根據(jù)不同的伴隨突變對FLT3突變陽性AML患者進行更加精細的風(fēng)險分層。