時杜娟，黃云霞，蒙玉娜，馬淑萍，李紅玲

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,寧夏銀川 750000；2.甘肅省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，甘肅蘭州 730000

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是成人淋巴瘤中最常見的組織亞型，占成人非霍奇金淋巴瘤的25%～35%[1]，具有高度異質(zhì)性，可原發(fā)也可由惰性B細(xì)胞淋巴瘤轉(zhuǎn)化而來。在過去20年中，R-CHOP方案成為治療DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)方案，患者治愈率為50%～70%，但復(fù)發(fā)和難治病例仍然高達(dá)40%[2]，因此，尋找新的標(biāo)志物對于DLBCL的診療具有重要的臨床意義。

刺猬(HH)信號通路最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，目前研究表明，HH信號通路不僅對胚胎發(fā)育至關(guān)重要，并且對成年生物體的組織和器官穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用，該通路的激活可影響與增殖、血管生成及干細(xì)胞自我更新相關(guān)的靶基因的表達(dá)[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HH信號通路的異常激活可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、轉(zhuǎn)移，血管生成，遺傳不穩(wěn)定性和腫瘤干細(xì)胞的自我更新等方式參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。音猬因子(Shh)、平滑受體蛋白(Smo)及神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1(Gli1)作為這條信號通路的關(guān)鍵蛋白因子，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過免疫組織化學(xué)SP法檢測Shh、Smo、Gli1在DLBCL組織中的表達(dá)情況，探討Shh、Smo、Gli1表達(dá)與DLBCL臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以期為DLBCL的診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集甘肅省人民醫(yī)院2016年1月至2020年12月首次經(jīng)病理學(xué)確診的DLBCL患者石蠟包埋組織標(biāo)本58例。其中來源于男性32例，女性26例；患者年齡15～83歲，中位年齡54歲。收集同期20例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者的淋巴組織作為對照。入選患者均未行抗腫瘤治療，所有患者均以相應(yīng)組織的病理活檢結(jié)果為診斷依據(jù)，診斷參照《淋巴瘤病理診斷》[5]。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)范并獲甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 從醫(yī)院病歷記錄中收集患者以下臨床資料：年齡、性別、An-Arbor臨床分期、B癥狀、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分、骨髓侵犯情況，以及乳酸脫氫酶(LDH)、β2微球蛋白(β2-MG)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。入選患者的淋巴組織標(biāo)本使用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋并連續(xù)切片，厚度為4 μm，使用免疫組織化學(xué)SP法檢測DLBCL組織及淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中Shh、Smo、Gli1的表達(dá)水平。兔抗人Shh多克隆抗體、兔抗人Smo多克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗人Gli1多克隆抗體購自GeneTex公司。檢測過程按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，Shh、Smo、Gli1試劑工作濃度均為1∶200，一抗對照使用磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn) 鏡下觀察制備好的切片，采用半定量積分法：根據(jù)著色強(qiáng)度和著色細(xì)胞所占百分比綜合判斷。分別對Shh、Smo、Gli1陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度兩個變量進(jìn)行評分，以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，采用陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度之積對結(jié)果進(jìn)行判定。陽性細(xì)胞的評分如下：0～5%計0分，>5%～25%計1分，>25%～50%計2分，>50%～75%計3分，>75%～100%計4分。染色強(qiáng)度評分如下：未染色者為陰性，計0分；淡黃色者為弱染色，計1分；棕黃色者為中度染色，計2分；棕褐色者為強(qiáng)染色，計3分。將上述兩項評分結(jié)果相乘：0分為陰性；1～12分為陽性，其中1～4分(+，弱陽性)，5～8分(++，中度陽性)，9～12分(+++，強(qiáng)陽性)。以上步驟均由兩位具有豐富臨床經(jīng)驗的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗；等級變量之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Shh、Smo、Gli1在DLBCL組織及淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中的表達(dá) Shh在58例DLBCL組織中的陽性率為34.5%(20/58)，而在20例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中的陽性率為5.0%(1/20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.194，P<0.05)。DLBCL組織中Smo陽性率為41.4%(24/58)，明顯高于淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織的5.0%(1/20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.145，P<0.05)。Gli1在DLBCL組織中的陽性率為29.3%(17/58)，在淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中未見陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.307，P<0.05)。見圖1。

2.2Shh、Smo、Gli1表達(dá)與DLBCL患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 Shh、Smo、Gli1的表達(dá)均與DLBCL患者的Ann-Arbor臨床分期有關(guān)(P<0.05)，且分期越晚(Ⅲ+Ⅳ期)，Shh、Smo、Gli1的陽性率越高。Shh的表達(dá)還與IPI評分有關(guān)(P<0.05)，Smo的表達(dá)還與骨髓侵犯有關(guān)(P<0.05)，而Gli1的表達(dá)還與IPI評分、B癥狀有關(guān)(P<0.05)。但三者與患者的年齡、性別，以及LDH、β2-MG、CRP水平無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 Shh、Smo、Gli1表達(dá)與DLBCL患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系(n)

2.3Shh、Smo、Gli1在DLBCL組織中表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，Shh與Smo的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.571，P<0.01)，Shh與Gli1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.678，P<0.01)，Smo與Gli1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.662，P<0.01)。見表2～4。

表2 Shh與Smo在DLBCL組織中的表達(dá)情況(n)

表3 Shh與Gli1在DLBCL組織中的表達(dá)情況(n)

表4 Smo、Gli1在DLBCL組織中的表達(dá)情況(n)

3 討 論

多項研究表明，HH信號通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中存在異常激活[6-7]。在該通路中，目前研究最為深入的是Shh配體，其活性最高，并參與胚胎發(fā)育過程中各器官的發(fā)育。Shh配體已被證明通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤干細(xì)胞的擴(kuò)張來驅(qū)動癌癥的進(jìn)展。Smo是HH信號通路中的一個輔助受體，它在結(jié)構(gòu)上類似于G蛋白偶聯(lián)受體，被認(rèn)為是一種積極的HH信號通路調(diào)節(jié)因子。Gli1作為該通路的最終靶標(biāo)，為HH信號通路提供正反饋。HH信號通路在腫瘤中的異常激活存在多種方式，包括依賴配體的激活及非依賴配體的激活，其中依賴配體的激活還包括自分泌、旁分泌機(jī)制和反向旁分泌機(jī)制[8]。有研究報道，在基底細(xì)胞癌患者中經(jīng)常出現(xiàn)表達(dá)Smo的體細(xì)胞突變，這是通過非依賴配體的方式激活HH信號通路[9]，在髓母細(xì)胞瘤(MB)中也存在同樣的方式，TAN等[10]由此分析了38例MB的Shh亞型(Shh-MB)患者的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示80%的Smo突變優(yōu)先在小腦半球中形成，在成人腫瘤中Smo突變率更高，從而推測成人Shh-MB的突變似乎會影響腫瘤的定位。

目前關(guān)于HH信號通路在DLBCL中的作用研究甚少，故本研究通過免疫組織化學(xué)SP法檢測了DLBCL組織中Shh、Smo、Gli1的表達(dá)情況。結(jié)果表明，Shh、Smo、Gli1在DLBCL組織中的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織，Shh、Smo、Gli1的表達(dá)均與Ann-Arbor臨床分期有關(guān)(P<0.05)，這表明以Shh為配體的HH信號通路可能在DLBCL的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Shh的表達(dá)還與IPI評分有關(guān)(P<0.05)，而Smo的表達(dá)還與骨髓侵犯有關(guān)(P<0.05)，Gli1的表達(dá)與IPI評分、B癥狀有關(guān)(P<0.05)。有報道稱，Shh和Gli1為接受治療性手術(shù)的胰腺癌患者提供了重要和獨立的預(yù)后信息，腫瘤細(xì)胞低水平表達(dá)Gli1或Shh與較長的無病生存期和總生存期有關(guān)，Gli1和Shh是潛在的生物預(yù)后標(biāo)志物[11]?？傊?，HH信號通路可能參與了DLBCL細(xì)胞的增殖并促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

近年來以HH信號通路關(guān)鍵蛋白為作用靶點的抗腫瘤藥物研究也是一大熱點，ALAM等[12]研究表明，運用Shh抑制劑環(huán)巴胺可以抑制大鼠腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，減緩腫瘤的增殖和侵襲。針對Smo基因位點的抑制劑，通過抑制Smo活性可直接阻斷Gli1轉(zhuǎn)錄因子的激活，抑制下游基因的表達(dá)。目前維莫德吉和索尼吉布已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市用于治療基底細(xì)胞癌[13-14]，但是隨著獲得性耐藥的出現(xiàn)也限制了Smo抑制劑的長期療效[15]。目前針對Gli1基因的靶向抑制劑有GANT61、ATO、格拉斯吉布和GANT58等，格拉斯吉布和小劑量阿糖胞苷聯(lián)用也被美國FDA批準(zhǔn)用于治療急性粒細(xì)胞白血病[16]。這為使用HH信號通路抑制劑聯(lián)合其他藥物治療惡性腫瘤提供了一個新的思路。

本研究結(jié)果顯示，在DLBCL組織中存在HH信號通路的過度激活，并參與了DLBCL的發(fā)生、發(fā)展，這表明Shh配體介導(dǎo)的HH信號通路的過度激活在DLBCL的疾病進(jìn)展中發(fā)揮獨特的作用。但由于納入樣本量有限，時間跨度較大，可能造成選擇性偏倚，導(dǎo)致統(tǒng)計結(jié)果出現(xiàn)差異。并且目前部分樣本的隨訪時間較短，因此,三者是否與DLBCL患者的生存期及預(yù)后有關(guān)仍需要進(jìn)一步驗證并隨訪。

綜上所述，本研究的結(jié)果顯示Shh、Smo、Gli1在DLBCL中過表達(dá)，表明HH信號通路與DLBCL發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望為DLBCL的治療提供新的思路。關(guān)于HH信號通路在DLBCL發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制及與預(yù)后的相關(guān)性目前仍有待進(jìn)一步的研究。