李豫 陳剛 馬騫 鄺杰華 陳有銘

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524025；2. 廣東藍(lán)糧種業(yè)有限公司，湛江 524000）

在魚(yú)類的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，生殖細(xì)胞系與體細(xì)胞系發(fā)生分離并形成原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs），隨著胚胎的發(fā)育PGCs遷移至性腺原基，并逐步轉(zhuǎn)化為生殖干細(xì)胞（精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞），隨后經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂和進(jìn)一步的發(fā)育，最終形成成熟的精子和卵子［1］。從PGCs起源到配子發(fā)生的整個(gè)過(guò)程受基因、激素、環(huán)境因子等多種因素的調(diào)控，然而其分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。近年來(lái)，越來(lái)越多生殖細(xì)胞相關(guān)基因，如vasa、dnd、nanos、dazl等被廣泛地應(yīng)用于PGCs的起源和遷移研究，這些基因的發(fā)現(xiàn)有助于揭示生殖細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控機(jī)制［2-5］。

nanos基因最早在果蠅（Drosophila melanogaster）中被確認(rèn)為一種母源效應(yīng)基因，編碼一種含有兩個(gè)鋅指基序（Cys-Cys-His-Cys，CCHC）的RNA結(jié)合蛋白，可介導(dǎo)果蠅腹部的形成，并在多種生物的PGCs發(fā)生、遷移和存活以及生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6-7］。研究表明，nanos基因功能的缺失會(huì)導(dǎo)致PGCs過(guò)早進(jìn)行有絲分裂，無(wú)法進(jìn)行正常遷移并最終發(fā)生凋亡，還可能導(dǎo)致胚胎的大量死亡，對(duì)生殖干細(xì)胞的形成和維持也會(huì)產(chǎn)生一定的影響［8-9］。nanos基因存在3種同源基因，分別為nanos1、nanos2和nanos3，其基因功能在不同物種中存在差異［10］。在脊椎動(dòng)物中，nanos1基因?qū)C(jī)體的調(diào)控作用存在較大差異。小鼠（Mus musculus）nanos1基因在PGCs中不表達(dá)，而生精細(xì)胞和卵母細(xì)胞中則可以檢測(cè)到nanos1基因的表達(dá)信號(hào)；敲除nanos1基因后，小鼠未出現(xiàn)任何異常，且具有正常的生殖功能［11］。在魚(yú)類中，施氏鱘（Acipenser schrenckii）nanos1基因在除心臟外的所有組織中均有表達(dá)，其中，卵巢中的表達(dá)水平最高［12］。斜帶石斑魚(yú)包含兩種類型的nanos1（nanos1a和nanos1b），其表達(dá)模式各不相同，其中nanos1a在斜帶石斑魚(yú)垂體中的動(dòng)態(tài)變化與其精巢分化和精子的形成相關(guān)［4］。抑制斑馬魚(yú)（Danio rerio）胚胎發(fā)育過(guò)程中nanos1基因的表達(dá)，將對(duì)其PGCs的遷移和存活產(chǎn)生影響［13］。此外，在其它魚(yú)類中也相繼克隆出nanos1的同源基因，包括河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）［14］、大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）［15］、中 華 鱘（A. sinensis）［7］、黑脊倒刺鲃（Spinibarbus caldwelli）［16］等。

軍曹魚(yú)（Rachycentron canadum），隸屬于鱸形目（Perciformes）、軍曹魚(yú)科（Rachycentridae）、軍曹魚(yú)屬（Rachycentron），又稱為海鱺和海龍魚(yú)，是一種大型的遠(yuǎn)洋洄游性魚(yú)類［17］。軍曹魚(yú)因其生長(zhǎng)速度極快、抗病能力強(qiáng)以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，已成為我國(guó)極具前景的海水養(yǎng)殖魚(yú)類之一，目前在超過(guò)23個(gè)國(guó)家和地區(qū)啟動(dòng)了軍曹魚(yú)的研究和開(kāi)發(fā)工作，其中一半集中在亞太地區(qū)［18-20］。為了促進(jìn)軍曹魚(yú)的規(guī)?；N苗培育及種質(zhì)資源改良工作，需對(duì)其性腺發(fā)生發(fā)育作進(jìn)一步研究。

本研究以軍曹魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，克隆分析Rcnanos1基因cDNA全長(zhǎng)序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)Rcnanos1基因在13種組織中的表達(dá)分布以及在胚胎和性腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，為闡明nanos1基因在硬骨魚(yú)類胚胎發(fā)育和配子發(fā)生過(guò)程中的生理功能及其調(diào)節(jié)作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的軍曹魚(yú)胚胎于2019年4月采自廣東海洋大學(xué)海洋生物研究基地。從海上網(wǎng)箱中挑選自養(yǎng)的3-4齡以上成魚(yú)作為親魚(yú)，在室外水泥池（100 m3）中強(qiáng)化培育，注射LRH-A2和HCG催產(chǎn)，雌魚(yú)注射劑量為L(zhǎng)RH-A28 μg/kg + HCG 1 200 IU/kg，雄魚(yú)的注射量為雌魚(yú)的1/2，效應(yīng)時(shí)間為10-12 h。準(zhǔn)確掌握親魚(yú)的產(chǎn)卵時(shí)間，將受精卵置于培養(yǎng)皿內(nèi)，在顯微鏡下進(jìn)行連續(xù)觀察，現(xiàn)場(chǎng)記錄胚胎不同發(fā)育期的時(shí)序及形態(tài)特征，分別采集2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期、多細(xì)胞期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、器官形成期、孵化期及孵化后1 d的胚胎樣品，經(jīng)0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水沖洗后放入裝有RNA Later的EP管內(nèi)，4℃靜置過(guò)夜后轉(zhuǎn)存至-80℃待用。

不同發(fā)育期的軍曹魚(yú)性腺組織于2019年6月-2020年4月采自廣東省茂名市某工廠化養(yǎng)殖基地。軍曹魚(yú)幼魚(yú)飼養(yǎng)于直徑9 m、水深2.5 m的金屬圓形水池內(nèi)，流水充氣，養(yǎng)殖鹽度27.0%-30.5%，溫度25.0-30.0℃，分別對(duì)90、120、150、185、210和360 dph體質(zhì)良好的軍曹魚(yú)進(jìn)行采樣，其中，雌魚(yú)共23尾，體重215.0-5 050.0 g，體長(zhǎng)29.8-68.5 cm；雄魚(yú)共18尾，體重230.0-4 225.0 g，體長(zhǎng)29.2-64.5 cm。軍曹魚(yú)經(jīng)40 mg/L丁香酚麻醉，解剖取出性腺進(jìn)行性別鑒定，隨后將性腺組織浸入RNA Later中，4℃靜置過(guò)夜，最后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。此外，選取150 dph軍曹魚(yú)雌雄各1尾，將其腦、肌肉、鰓、肝、腸、胃、脾、體腎、心、皮膚、眼睛、精巢和卵巢分離，經(jīng)DEPC水沖洗后放入RNA Later中，-80℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 Rcnanos1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 將采集的軍曹魚(yú)卵巢放入液氮中進(jìn)行研磨，采用Trizol法（Invitrogen）提取總RNA。通過(guò)SimpliNano超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA濃度和純度，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。參照EasyScript One-step cDNA Synthesis試 劑 盒（TransGen）說(shuō) 明書(shū)，將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，另取2 μg總RNA，按照SMARTer? RACE 5'/3' Kit試劑盒（Clontech）說(shuō)明合成5'/3' RACE-Ready cDNA。

從課題組前期獲得的軍曹魚(yú)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（暫未上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)）中提取Rcnanos1基因的CDS序列信息，使用Primer Premier5.0分別在序列兩端設(shè)計(jì)上下游特異性引物Rcnanos1-F和Rcnanos1-R（表1）。按 照95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s共35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min 的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段用Gel Extraction Kit（TransGen）純化回收，純化產(chǎn)物連接到pMD-18T（TaKaRa）載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選挑取單克隆陽(yáng)性菌落由生工生物工程公司（廣州）測(cè)序。根據(jù)測(cè)序片段，分別在靠近序列5'和3'末端各設(shè)計(jì)2條RACE引物Rcnanos1 5'-R1/R2和Rcnanos1 3'-F1/F2（表1），采用巢式PCR的方法獲取Rcnanos1基因5'和3'末端序列。

1.2.2 序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析 根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，利用DNAMAN軟件將序列進(jìn)行拼接，得到Rcnanos1基因全長(zhǎng)cDNA序列。將預(yù)測(cè)的RcNanos1氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其它物種的序列進(jìn)行BLASTP一致性比對(duì)；下載其它硬骨魚(yú)類及高等脊椎動(dòng)物的Nanos1同源氨基酸序列，使用Clustalx1.83進(jìn)行序列多重比對(duì)分析，通過(guò)GenDoc 軟件將比對(duì)結(jié)果輸出；使用MEGA5.0軟件以鄰接法（Neighbour-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，針對(duì)進(jìn)化樹(shù)各分支結(jié)點(diǎn)均進(jìn)行1 000次重復(fù)計(jì)算檢驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 通過(guò)組織學(xué)觀察并參照劉筠［21］對(duì)魚(yú)類性腺的分期方法，依據(jù)性腺中生殖細(xì)胞的種類、成熟度、數(shù)量占比及排列方式進(jìn)行發(fā)育分期的劃分，提取軍曹魚(yú)不同發(fā)育期胚胎和性腺組織以及150 dph軍曹魚(yú)個(gè)體各組織的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。基于測(cè)序獲得的Rcnanos1基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增引物Rcnanos1-F1/R1，以軍曹魚(yú)β-actin作為內(nèi)參基因（表1），qRT-PCR實(shí)驗(yàn)流程按照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa）說(shuō)明進(jìn)行操作，使用ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)Rcnanos1基因的組織表達(dá)分布及在胚胎和性腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)測(cè)得的Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算Rcnanos1的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD，n=3）表示，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差（One-way ANOVA）分析及Duncan’s多重比較，當(dāng)P＜0.05，表示有顯著性差異。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

2 結(jié)果

2.1 Rcnanos1 cDNA全長(zhǎng)及序列分析

實(shí)驗(yàn)克隆所得的Rcnanos1序列全長(zhǎng)為1 290 bp，其中5'非編碼區(qū)139 bp，3'非編碼區(qū)470 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度681 bp，共編碼226個(gè)氨基酸，已提交NCBI GenBank（登錄號(hào)：MW436699）；預(yù)測(cè)的編碼蛋白的分子質(zhì)量為24.77 kD，等電點(diǎn)（pI）為8.74。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在推導(dǎo)的RcNanos1氨基酸序列的C端具有兩個(gè)連續(xù)且高度保守的鋅指功能結(jié)構(gòu)域（圖1，2）。氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果顯示，軍曹魚(yú)Nanos1氨基酸序列與鱸形目魚(yú)類的一致性最高，如與尖吻鱸和斜帶石斑魚(yú)的序列一致性分別高達(dá)99.6%和99.1%，與小鼠（Mus musculus）和智人（Homo sapiens）等的序列一致性則較低，僅為30.9%和27.7%（圖2）。

圖1 Rcnanos1 cDNA全長(zhǎng)序列和氨基酸序列分析Fig.1 Complete sequence of Rcnanos1 cDNA and analysis of deduced amino acid sequence

圖2 軍曹魚(yú)nanos1氨基酸序列多重序列比對(duì)分析Fig.2 Multiple alignment of R. canadum nanos1 deduced amino acid sequence

基于軍曹魚(yú)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的其它物種Nanos1氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中（圖3），軍曹魚(yú)與其它硬骨魚(yú)類聚為一簇，哺乳類、鳥(niǎo)類和兩棲類等高等脊椎動(dòng)物則聚為另一簇，其中，軍曹魚(yú)先與尖吻鱸和斜帶石斑魚(yú)聚為一支，在物種進(jìn)化上距離最近，其次與大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、大西洋鮭（Salmo salar）、日本青鳉（Oryzias latipes）、高體鰤（Seriola dumerili）等分支聚為一簇。

圖3 基于nanos1氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（NJ樹(shù)）Fig.3 Phylogenetic tree of nanos1 amino acid sequences based on Neighbor-Joining（NJ）method

2.2 Rcnanos1的組織表達(dá)分布模式

qRT-PCR檢測(cè)了Rcnanos1在150 dph軍曹魚(yú)各組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，Rcnanos1在13種組織中均有表達(dá)，其中在性腺中的表達(dá)水平最高，顯著高于其它組織，并且卵巢中的表達(dá)水平顯著高于精巢；其次是心臟、腦、眼、皮膚和肌肉；在肝、脾、體腎、鰓、胃和腸中的表達(dá)水平最低（圖4）。

圖4 qRT-PCR分析Rcnanos1在軍曹魚(yú)不同組織中的表達(dá)Fig.4 Expressions of Rcnanos1 in the tissues of R. canadum by qRT-PCR

2.3 Rcnanos1在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rcnanos1在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其在1細(xì)胞期、2細(xì)胞期、4細(xì)胞期和8細(xì)胞期中的表達(dá)量均無(wú)顯著差異，從16細(xì)胞期開(kāi)始表達(dá)量出現(xiàn)顯著升高，隨后由多細(xì)胞期發(fā)育至器官形成期的過(guò)程中，表達(dá)水平趨于穩(wěn)定且無(wú)顯著變化；孵化期時(shí)，Rcnanos1的表達(dá)量進(jìn)一步顯著升高，直至胚胎孵化后1 d，Rcnanos1的表達(dá)量達(dá)到峰值，約為1細(xì)胞期的2.8倍（圖5）。

圖5 Rcnanos1在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析Fig.5 Expressions of Rcnanos1 during the embryonic development stages

2.4 Rcnanos1在性腺首周年發(fā)育過(guò)程中的表達(dá) 模式

90-360 dph軍曹魚(yú)的精巢共分為4個(gè)發(fā)育時(shí)期，包括精母細(xì)胞增長(zhǎng)期（Ⅱ期）、精母細(xì)胞成熟期（Ⅲ期）、精子變態(tài)期（Ⅳ期）和精子成熟期（Ⅴ期）。90 dph時(shí)，精巢處于Ⅱ期；120 dph時(shí)，精巢處于Ⅱ-Ⅲ 期；150 dph和185 dph的精巢均處于Ⅲ期，而210 dph和360 dph的精巢分別處于Ⅳ期和Ⅴ期。在精巢發(fā)育過(guò)程中，Rcnanos1的表達(dá)水平呈逐漸升高趨勢(shì)，90 dph時(shí)的表達(dá)量最低，隨后表達(dá)水平出現(xiàn)顯著升高，并于360 dph時(shí)上升至表達(dá)量的峰值，約為90 dph的3.6倍（圖6-A）。90-360 dph軍曹魚(yú)的卵巢可分為卵原細(xì)胞增殖期（Ⅰ期）、卵母細(xì)胞小生長(zhǎng)期（Ⅱ期）、初級(jí)卵母細(xì)胞大生長(zhǎng)期（Ⅲ期）。90 dph時(shí)，卵巢處于Ⅰ期；120 dph時(shí)，卵巢處于Ⅰ-Ⅱ期；150 dph、185 dph和210 dph的卵巢均處在Ⅱ期；360 dph時(shí)，卵巢發(fā)育至Ⅲ期。在卵巢發(fā)育過(guò)程中，Rcnanos1的表達(dá)水平呈不斷上升的變化趨勢(shì)，其在90 dph的表達(dá)量最低，120-360 dph的表達(dá)量均顯著高于90 dph，其中120 dph、150 dph和185 dph三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量無(wú)顯著差異；360 dph時(shí)，Rcnanos1的表達(dá)量顯著升高至最大值，約為90 dph的3.1倍（圖6-B）。

圖6 軍曹魚(yú)性腺周年發(fā)育過(guò)程中Rcnanos1 mRNA的表達(dá)水平Fig.6 Rcnanos1 mRNA expression in annual gonadal development of R. canadum

3 討論

本研究利用RACE技術(shù)首次克隆了軍曹魚(yú)nanos1基因的全長(zhǎng)序列，其全長(zhǎng)為1 290 bp，共編碼226個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列與尖吻鱸的一致性高達(dá)99.6%。RcNanos1包含兩個(gè)連續(xù)且高度保守的鋅指功能結(jié)構(gòu)域，與已報(bào)道的小斑點(diǎn)角鯊（Scylorhinus canicula）［22］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［10］、果 蠅［23］、非 洲 爪 蟾（Xenopus laevis）［24］等 物 種 的Nanos1同源蛋白的結(jié)構(gòu)相似。相關(guān)研究表明，鋅指結(jié)構(gòu)域是RNA的結(jié)合部位，在維持nanos1的功能上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［25］。雖然不同物種間nanos1基因序列存在一定差異，但其RNA結(jié)合功能域的氨基酸序列在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，軍曹魚(yú)Nanos1屬于硬骨魚(yú)類的進(jìn)化分支，且與尖吻鱸和斜帶石斑魚(yú)的親緣關(guān)系最接近，也進(jìn)一步表明克隆的Rcnanos1基因?qū)儆隰~(yú)類nanos1同源基因。

基于qRT-PCR檢測(cè)的組織表達(dá)分布結(jié)果顯示，Rcnanos1在150 dph軍曹魚(yú)的13種組織中均有表達(dá)，其中，性腺中的表達(dá)豐度最高，而卵巢中的表達(dá)水平又顯著高于精巢，與施氏鱘［12］的組織表達(dá)模式相似，暗示Rcnanos1可能與軍曹魚(yú)性腺發(fā)育相關(guān)，且在卵巢發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮更顯著的調(diào)控作用。然而大黃魚(yú)nanos1在精巢中的表達(dá)水平要顯著高于卵巢［15］；在中華鱘的研究中發(fā)現(xiàn)，nanos1在除脂肪外所有組織中均有表達(dá)，但垂體和端腦中的表達(dá)量最高，而卵巢中的表達(dá)量則較低［7］，上述結(jié)果表明nanos1的組織表達(dá)模式具有明顯的物種差異性。相關(guān)報(bào)道證實(shí)，nanos1在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中具有一定的作用，Zhu等［14］發(fā)現(xiàn)河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）nanos1基因在腦組織中的表達(dá)水平最高且顯著高于其它組織，表明其在神經(jīng)系統(tǒng)中可發(fā)揮一定的功能。Ye等［26］的研究表明，果蠅nanos1基因可參與外周神經(jīng)系統(tǒng)的形成。此外，在人類、小鼠、非洲爪蟾等高等脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中均可檢測(cè)到nanos1的表達(dá)［10］，而本研究發(fā)現(xiàn)Rcnanos1在腦組織中有較高的表達(dá)水平，由此推測(cè)Rcnanos1也可能在軍曹魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮相關(guān)功能，關(guān)于其具體調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步的探究。

據(jù)報(bào)道，nanos基因參與PGCs的遷移和維持，在生殖干細(xì)胞的更新及生殖細(xì)胞的發(fā)育中起到關(guān)鍵作用，nanos基因發(fā)生突變后，可抑制PGCs的形成及分裂，甚至造成胚胎的死亡［1］，因此研究nanos基因在胚胎發(fā)育中的表達(dá)具有重要意義。本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了Rcnanos1在軍曹魚(yú)胚胎發(fā)育12個(gè)不同時(shí)期中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Rcnanos1在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，表明Rcnanos1可能參與軍曹魚(yú)胚胎發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，然而在大黃魚(yú)整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中均未檢測(cè)到nanos1基因的表達(dá)［15］。Rcnanos1在胚胎發(fā)育早期的表達(dá)水平較低，16細(xì)胞期時(shí)表達(dá)量開(kāi)始顯著升高，表明Rcnanos1可能在卵裂后的胚體形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但在早期卵裂階段的作用不顯著。當(dāng)胚胎發(fā)育至多細(xì)胞期后，Rcnanos1在囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期和器官形成期中的表達(dá)均維持在較高水平。目前，研究學(xué)者普遍認(rèn)為PGCs主要起源于中胚層或內(nèi)胚層［27］，而原腸胚期是形成外、中、內(nèi)3種胚層的時(shí)期，可為胚體器官的形成奠定基礎(chǔ)［28］。此外，關(guān)于PGCs遷移的研究表明，PGCs起源后主要通過(guò)臟壁中胚層從腸道側(cè)膜遷移至生殖嵴，或沿著體壁中胚層通過(guò)體節(jié)進(jìn)行遷移后到達(dá)生殖嵴［29］。上述研究表明Rcnanos1可能與PGCs的形成及遷移相關(guān)，并可能參與胚胎的器官形成過(guò)程。Rcnanos1在孵化出膜階段的表達(dá)量顯著升高，暗示Rcnanos1可能在胚體孵化后的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要的作用，但具體的調(diào)控機(jī)制仍需通過(guò)進(jìn)一步的原位雜交及功能分析闡明。

基于Rcnanos1在軍曹魚(yú)精巢和卵巢中的表達(dá)較強(qiáng)，本研究進(jìn)一步分析了Rcnanos1在性腺首周年發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。隨著精巢和卵巢發(fā)育，Rcnanos1的表達(dá)水平呈逐漸升高的趨勢(shì)，且均在360 dph時(shí)達(dá)到表達(dá)量的峰值，此時(shí)精巢和卵巢分別處于精子成熟期（Ⅴ期）和初級(jí)卵母細(xì)胞大生長(zhǎng)期（Ⅲ期），表明Rcnanos1可能參與調(diào)控軍曹魚(yú)精子和卵子的發(fā)生過(guò)程。然而，河川沙塘鱧nanos1的表達(dá)水平隨著精巢發(fā)育（Ⅰ-Ⅳ期）呈不斷下降的趨勢(shì)，在卵巢發(fā)育過(guò)程中則呈先下降（Ⅰ-Ⅲ期）后上升（Ⅳ期）的趨勢(shì)，表明不同物種間nanos1基因在性腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式存在一定差異，由此推測(cè)nanos1基因在配子發(fā)生過(guò)程中的調(diào)控作用同樣存在種間差異。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得的Rcnanos1基因與其它魚(yú)類的保守性較高，在各組織中均有表達(dá)，其中，在性腺中的表達(dá)量最高。在軍曹魚(yú)胚胎發(fā)育和性腺周年發(fā)育過(guò)程中，Rcnanos1表達(dá)水平總體均呈逐漸升高的趨勢(shì)，表明Rcnanos1基因可能在軍曹魚(yú)胚胎和性腺發(fā)育過(guò)程發(fā)揮一定的調(diào)控作用。