周 慧，吳海霞，謝 偉，王蕓蕓，蔣琦辰，李 鵬

(1.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210023；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023；3.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京 210017)

生物鐘又稱“晝夜節(jié)律鐘”或“近日時(shí)間節(jié)律鐘”，是生物體適應(yīng)環(huán)境周期性變化的內(nèi)在計(jì)時(shí)機(jī)制，具有重要的功能[1]。Abe等[2]研究證實(shí)生物鐘基因調(diào)節(jié)生物體的穩(wěn)態(tài)，與炎癥反應(yīng)、血糖平衡、合成和分解代謝等有著密切的關(guān)系。晝夜節(jié)律的發(fā)生是以時(shí)鐘基因及其相關(guān)蛋白為物質(zhì)基礎(chǔ)[3]，例如時(shí)鐘基因(clock，Clk)與生物體生命健康息息相關(guān)，其蛋白產(chǎn)物CLOCK (CLK)屬于bHLH/PAS家族的轉(zhuǎn)錄因子，驅(qū)動(dòng)目標(biāo)時(shí)鐘基因以及與組織特異性轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的其他基因表達(dá)[4]。在生物鐘調(diào)控系統(tǒng)中，CLK蛋白通常與CYC蛋白形成異源二聚體，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，在反饋環(huán)中起正調(diào)控作用。它主要在視交叉上核和視網(wǎng)膜中表達(dá)，在外周組織器官(肝臟、心臟、肌肉、腎臟、胰臟、睪丸、卵巢等)中也有表達(dá)[5]。在對(duì)小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，敲除該基因的小鼠表現(xiàn)出生物節(jié)律紊亂，多巴胺在中腦頓腹部(Ventral Tegmental Area，VTA)的轉(zhuǎn)運(yùn)增加，由此推斷出CLK蛋白與腦回路中的多巴胺運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)[6]。敲除斑馬魚Clk基因，會(huì)導(dǎo)致其他幾個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)量下降[7]。

Cryptochrome(Cry)又被稱為“隱花色素基因”，其產(chǎn)物蛋白是一種對(duì)藍(lán)光極其敏感的黃素蛋白光受體，該蛋白是多細(xì)胞動(dòng)物核心晝夜節(jié)律振蕩器的組成部分，可調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)晝夜生物鐘光導(dǎo)引過(guò)程[8,9]。Cry基因是核心生物鐘基因，可分為3種基因類型：Cry1(或稱果蠅型Cry)、Cry2(或稱哺乳動(dòng)物型Cry)和Cry3。其中CRY2是昆蟲和哺乳動(dòng)物生物鐘的重要組成部分;而CRY1在果蠅研究中較為深入，在睡眠剝奪所引發(fā)的血管炎癥影響中發(fā)現(xiàn)，CRY1可明顯抑制血管炎癥的發(fā)生和發(fā)展[10]。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)肉質(zhì)結(jié)實(shí)，味道清新鮮美，是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類。但在克氏原螯蝦規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖過(guò)程中會(huì)遇到很多問(wèn)題，如苗種繁育不足、個(gè)體小型化、疾病防控落后等。謝偉等[11]研究表明克氏原螯蝦諸多生理與行為節(jié)律均受體內(nèi)生物鐘基因的調(diào)控，生物鐘基因?qū)耸显r的生長(zhǎng)發(fā)育和攝食行為具有很大影響。作為重要的經(jīng)濟(jì)蝦類，目前對(duì)克氏原螯蝦生物鐘相關(guān)基因的種類和功能研究還不夠全面，對(duì)其調(diào)控機(jī)制更是缺少了解，因此本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析Clk基因(命名為PcClk)與Cry1基因(命名為PcCry1)的一些理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)，并使用熒光定量PCR 技術(shù)(qRT-PCR)探究克氏原螯蝦這兩個(gè)生物鐘基因在不同溫度和光照協(xié)同作用模式下的mRNA表達(dá)差異情況，并從進(jìn)化生物學(xué)角度對(duì)克氏原螯蝦PcClk與PcCry1進(jìn)行選擇壓力分析，以期了解溫度和光照周期對(duì)克氏原螯蝦生物鐘節(jié)律的影響，為其健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

克氏原螯蝦樣品均采集于江蘇南通野外生境，選取8-12 cm健康的雄性克氏原螯蝦個(gè)體，以排除性別對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后對(duì)其進(jìn)行適應(yīng)馴化培養(yǎng)。

暫養(yǎng)馴化培養(yǎng)：在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水箱中飼養(yǎng)2周，用全光譜日光燈模擬室外自然光照，光照周期為12 h光照和12 h黑暗(12 LD)，用增氧泵24 h不間斷充氧并維持室溫在25℃左右；同時(shí)，在養(yǎng)殖箱底鋪滿沙石，并放置尼龍管、石塊、易拉罐，為克氏原螯蝦提供隱蔽處，減少其打斗頻率。暫養(yǎng)期間于早(8:00)晚(20:00)投喂蝦蟹專用顆粒飼料，并保證每天投喂量一樣，及時(shí)吸取殘餌，2 d換水一次，換水量約為原來(lái)的1/3。

馴化2周后，將樣品放置在24 LL (24 h光照)、12 LD (12 h光照和12 h黑暗)和24 DD (24 h黑暗)模式下培養(yǎng)。24 h黑暗處理是將實(shí)驗(yàn)室所有門窗使用不透光黑薄膜遮蔽，僅在喂食和換水時(shí)短暫開燈，其余時(shí)間均處于黑暗狀態(tài)；24 h光照處理是將處于自然光照射下的養(yǎng)殖水箱上方放置全光譜日光燈，并且24 h打開。由于在25℃、12 LD培養(yǎng)模式下克氏原螯蝦的生長(zhǎng)狀況最好，在24 LL、24 DD或者溫度過(guò)高時(shí)，其成活率會(huì)降低(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)，所以在每種光照周期下設(shè)置恒定溫度25℃，同時(shí)在12 LD的光照周期下設(shè)置20℃、25℃和30℃ 3個(gè)不同溫度進(jìn)行研究，水溫由加熱棒控制。在馴化期間正常喂食，馴化結(jié)束后分別挑取52只健康雄性克氏原螯蝦轉(zhuǎn)入各模式下繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后于時(shí)間點(diǎn)8:00、12:00、16:00、20:00、00:00，次日4:00和8:00分別對(duì)每組取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取兩只一組，共取3組平行實(shí)驗(yàn)組。每組取腦、眼柄、肝胰腺各約30 mg的組織，加入RNA保護(hù)試劑，勻漿后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和cDNA合成

將狀態(tài)良好的克氏原螯蝦肝胰腺、腦、眼柄組織分別取出，按Trizol試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)說(shuō)明書的方法提取總RNA，用焦碳酸二乙酯(Diethyl Pyrocarbonate，DEPC)處理水稀釋，使RNA沉淀溶解，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量；使用超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA進(jìn)行濃度定量測(cè)定。據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix (上海力敏實(shí)業(yè)有限公司)說(shuō)明，將獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA序列和氨基酸序列分析

用cDNA末端快速擴(kuò)增方法獲得的PcClk基因和PcCry1基因全長(zhǎng)，于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)進(jìn)行PcClk基因(MN908585)和PcCry1基因(MG659714.1) cDNA全長(zhǎng)完整性驗(yàn)證。使用ExPASy服務(wù)器(https://web.expasy.org/)[12]的ProtParam和ProtScale工具分析PcCLK蛋白、PcCRY1蛋白的理化性質(zhì)和疏水性。使用SignalP程序[13]預(yù)測(cè)信號(hào)肽，MotifScan程序查找motif，SMART軟件[14]分析結(jié)構(gòu)功能域，PSORT Ⅱ軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位，TMHMM v.2.0軟件[15]預(yù)測(cè)跨膜區(qū)，SWISS-MODEL網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)[16]。使用MEGA Ⅹ軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，驗(yàn)證PcCLK蛋白與PcCRY1蛋白在進(jìn)化過(guò)程中與其他同源蛋白的關(guān)系[17]。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)

使用Prime Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物[表1，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]，并對(duì)PcClk基因、PcCry1基因在不同光照和溫度協(xié)同作用模式下7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。使用StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)，按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒SYBR?Premix-TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)說(shuō)明書操作，熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (2×) 10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，cDNA (100 ng/μL) 1 μL，再加上去離子水7.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min，95℃ 5 s，62℃ 30 s，72℃ 15 s，72℃ 1 min，16℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后分析相關(guān)數(shù)據(jù)，采用比較CT值的方法(基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT)[18]來(lái)分析PcClk基因、PcCry1基因的相對(duì)表達(dá)水平。采用SPSS17.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析法(ANOVA)對(duì)不同處理組樣品進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

表1 PcClk基因和PcCry1基因mRNA表達(dá)檢測(cè)所用的引物信息Table 1 Primers information for detection of PcClk and PcCry1 genes mRNA expression

1.5 適應(yīng)性進(jìn)化分析

1.5.1 序列獲取

為研究克氏原螯蝦PcClk基因和PcCry1基因的適應(yīng)性進(jìn)化，選擇代表性節(jié)肢動(dòng)物物種進(jìn)行分析，涉及甲殼亞門、螯肢亞門和六足亞門。所有選取物種的Clk基因和Cry基因序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)直接下載，相關(guān)信息如表2、表3所示。

表2 用于適應(yīng)性進(jìn)化分析的各物種Clk基因序列信息Table 2 Genetic sequence information of Clk in various species for adaptive evolutionary analysis

表3 用于適應(yīng)性進(jìn)化分析的各物種Cry1基因序列信息Table 3 Genetic sequence information of Cry1 in various species for adaptive evolutionary analysis

1.5.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

去除所有序列的終止密碼子，使用將獲取的節(jié)肢動(dòng)物PcClk基因、PcCry1基因序列通過(guò)PRANK軟件進(jìn)行密碼子比對(duì)[19]。使用Trimal軟件處理密碼子的比對(duì)結(jié)果后，刪除一些低質(zhì)量或高變異度的序列區(qū)域，僅保留進(jìn)化保守的區(qū)域用于后續(xù)分析[20]。使用IQ-TREE自動(dòng)測(cè)試功能并選擇最佳替代模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。該系統(tǒng)發(fā)育樹同時(shí)也被用于后續(xù)構(gòu)建選擇壓力分析的樹文件。

1.5.3 選擇壓力分析

使用PAML 4.9軟件包的CODEML程序計(jì)算ω值，使用位點(diǎn)模型、分支模型和分支位點(diǎn)模型進(jìn)行進(jìn)化分析[22]。

首先使用位點(diǎn)模型檢測(cè)PcClk基因和PcCry1基因在節(jié)肢動(dòng)物數(shù)據(jù)集中受正選擇的位點(diǎn)，并比較Ma和Ma0，M0和M3，M1a和M2a，M7和M8，M8和M8a模型。接著，利用似然率檢測(cè)方法計(jì)算2ΔlnL值與自由度之間的卡方分布。然后，利用貝葉斯方法BEB (Bays Empirical Bays)計(jì)算位點(diǎn)的后驗(yàn)概率(Posterior Probability，PP)，若后驗(yàn)概率>0.8，則被認(rèn)為是潛在的正選擇位點(diǎn)[23]。此外，使用Datamonkey中的FEL、SLAC和FUBRA檢測(cè)正選擇位點(diǎn)，設(shè)置FEL和SLAC顯著水平小于0.2，F(xiàn)UBAR后驗(yàn)概率值大于0.8[24]。最后，整合PAML和Datamonkey篩選的正選擇位點(diǎn)，將同時(shí)被PAML和Datamonkey檢測(cè)到的位點(diǎn)視為顯著的正選擇位點(diǎn)，并標(biāo)注在模擬的克氏原螯蝦PcClk基因和PcCry1基因的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 PcClk、PcCry1基因序列與蛋白結(jié)構(gòu)特征

將PcClk核苷酸序列在NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與其他物種的Clk核苷酸同源性相似度區(qū)間為68%-92%，其中與十足目通訊螯蝦(Pacifastacusleniusculus)的Clk基因最為相似，相似度為92%，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果類似。同樣地，將PcCry1核苷酸序列在NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其與其他物種的PcCry1核苷酸同源性相似度區(qū)間為73%-84%，其核苷酸序列與美洲海螯蝦(Homarusamericanus)的Cry1基因最為相似，而氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示PcCRY1蛋白與美洲海螯蝦(Homarusamericanus)CRY2蛋白相似性最高，相似度為96%。

2.2 PcClk基因和PcCry1基因正選擇位點(diǎn)的定位

通過(guò)SWISS-MODEL網(wǎng)站預(yù)測(cè)得到克氏原螯蝦PcCLK和PcCRY1三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1)，強(qiáng)烈正選擇位點(diǎn)在三級(jí)結(jié)構(gòu)中的定位如圖1標(biāo)記所示。圖中顯示PcCLK蛋白與模板4f3l.1.B蛋白的匹配度最高，序列相似度為54.60%；PcCRY1蛋白與模板7d1c.1.A匹配度最高，序列相似度為71.72%。

圖1 克氏原螯蝦PcCLK和PcCRY1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(標(biāo)注為強(qiáng)烈正選擇位點(diǎn))Fig.1 Three-dimensional structure prediction results of PcCLK and PcCRY1 proteins of Procambarus clarkii (The strongly positive selection sites were labeled)

2.3 多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

基于MEGA Ⅹ軟件鄰接法的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，PcCLK與甲殼類動(dòng)物的CLK聚在一起，而PcCRY1與甲殼類動(dòng)CRY1聚在一起(圖2)。克氏原螯蝦PcCLK與南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、等足目蟲(Eurydicepulchra)的CLK蛋白形成甲殼動(dòng)物亞門分支；克氏原螯蝦PcCRY1與南美白對(duì)蝦、大型溞(Daphniamagna)、等足目蟲、歐洲沙蚤(Talitrussaltator)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的CRY1蛋白形成甲殼動(dòng)物亞門分支(圖2)。

圖2 基于鄰接法構(gòu)建的PcCLK和PcCRY1及其同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of PcCLK and PcCRY1 and their homologous proteins based on neighbor-joining method

2.4 PcClk基因和PcCry1基因表達(dá)水平分析

在12 LD、不同溫度條件下，PcClk基因、PcCry1基因在腦、眼柄、肝胰腺中的mRNA表達(dá)情況如圖3所示。PcClk基因在腦、眼柄、肝胰腺中的mRNA表達(dá)基本保持24 h的振蕩規(guī)律。隨著溫度的升高，PcClk基因在腦、眼柄中的mRNA表達(dá)特征均發(fā)生變化，表現(xiàn)為振蕩波動(dòng)增強(qiáng)、節(jié)律性更明顯，尤其在30℃條件下，PcClk的mRNA表達(dá)量整體上明顯上調(diào)。而在肝胰腺中，隨著溫度的升高，PcClk基因的mRNA表達(dá)波動(dòng)減弱，節(jié)律性相對(duì)20℃時(shí)變得不明顯。同樣地，隨著溫度的升高，PcCry1基因在腦和眼柄中的mRNA表達(dá)振蕩特征均發(fā)生變化，波動(dòng)增強(qiáng)，節(jié)律性更明顯。與PcClk基因類似的是，相對(duì)于20℃，25℃、30℃情況下PcCry1基因在肝胰腺中的mRNA表達(dá)趨于平緩，振蕩波動(dòng)減弱，節(jié)律不明顯。

圖3 克氏原螯蝦PcClk基因[(a)-(c)]和PcCry1基因[(d)-(f)]在不同溫度、不同組織中的mRNA表達(dá)水平(12 LD)Fig.3 mRNA expression levels of PcClk [(a)-(c)] and PcCry1 [(d)-(f)] genes of Procambarus clarkii under different temperatures and in different tissues (12 LD)

在25℃、不同光照周期培養(yǎng)下，PcClk基因、PcCry1基因在腦、眼柄、肝胰腺中的mRNA表達(dá)情況如圖4所示。在12 LD的光照周期下，腦、眼柄、肝胰腺中PcClk基因的mRNA表達(dá)有一定的振蕩節(jié)律；而在24 LL和24 DD光照周期下，振蕩節(jié)律發(fā)生改變，尤其是眼柄中PcClk基因的mRNA表達(dá)表現(xiàn)出無(wú)振蕩節(jié)律。PcCry1基因的mRNA在腦和眼柄中的表達(dá)都基本遵循著一定的振蕩節(jié)律，在12 LD和24 LL光照周期下，PcCry1的表達(dá)量在白天緩慢堆積，在客觀夜晚期間達(dá)到峰值，隨后緩慢下降。而PcCry1基因的mRNA在肝胰腺的表達(dá)與腦、眼柄有所區(qū)別：在12 LD的光照周期下mRNA表達(dá)有一定的振蕩節(jié)律，但在24 LL和24 DD光照周期下振蕩波動(dòng)減弱，節(jié)律不明顯。

2.5 克氏原螯蝦PcClk基因、PcCry1基因的適應(yīng)性進(jìn)化分析結(jié)果

2.5.1 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

利用包括克氏原螯蝦在內(nèi)的節(jié)肢動(dòng)物PcClk基因和PcCry1基因序列，基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖5所示，PcClk基因和PcCry1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分為3個(gè)主要的進(jìn)化枝：甲殼動(dòng)物亞門進(jìn)化枝(Crustacea clade)、六足動(dòng)物亞門進(jìn)化枝(Hexapoda clade)和螯肢動(dòng)物亞門進(jìn)化枝(Chelicerata clade)。

2.5.2 選擇壓力分析

為研究克氏原螯蝦PcClk基因和PcCry1基因是否受到正選擇作用，首先假設(shè)同一個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹所有分支都有同一個(gè)ω值。PcClk基因和PcCry1基因one-ratio模型結(jié)果顯示，ω值分別為0.023和0.029，顯著小于1，表明該基因整體上受純化選擇作用(表4、表5)。Free-ratio模型假定系統(tǒng)發(fā)育樹上每一分支和節(jié)點(diǎn)都具有獨(dú)立的ω值，結(jié)果顯示free-ratio模型顯著優(yōu)于one-ratio模型(P<0.05)，提示不同支系具有不同的進(jìn)化速率。以克氏原螯蝦為前景枝，這兩個(gè)基因two-ratio模型擬合效果并沒(méi)有明顯優(yōu)于one-ratio模型(P>0.05)，表明克氏原螯蝦PcClk基因、PcCry1基因與其他近緣甲殼動(dòng)物有相似的進(jìn)化速率(表4、表5)。其次，使用位點(diǎn)模型，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的M1a模型和M2a模型、M7模型和M8a模型、M8模型和M8a模型之間均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，而PcClk基因的M0模型和M3模型有顯著差異(P<0.05)。最后，使用分支位點(diǎn)模型檢測(cè)PcClk基因、PcCry1基因，PcCry1基因的Ma模型優(yōu)于Ma0模型(P<0.01)。

表4 分支模型、位點(diǎn)模型和分支位點(diǎn)模型對(duì)PcClk基因的選擇壓力分析Table 4 Selective pressure analysis of the PcClk gene based on branch model,site model and branch-site model

表5 分支模型、位點(diǎn)模型和分支位點(diǎn)模型對(duì)PcCry1基因的選擇壓力分析Table 5 Selective pressure analysis of the PcCry1 gene based on branch model,site model and branch-site model

續(xù)表5Continued table 5

通過(guò)PAML篩選，結(jié)果顯示PcClk基因沒(méi)有正選擇位點(diǎn)，而PcCry1基因中鑒定有121個(gè)正選擇位點(diǎn)(表6)。為得到更加精確的結(jié)果，進(jìn)一步使用Datamonkey網(wǎng)站中的FEL、FUBAR和SLAC 3種方法檢測(cè)，共檢測(cè)到PcClk基因有2個(gè)正選擇位點(diǎn)，PcCry1基因有1個(gè)正選擇位點(diǎn)。最終，PcClk基因中的71，218位點(diǎn)可被FEL、SLAC同時(shí)檢測(cè)出來(lái)，而PcCry1基因中的63位點(diǎn)可被PAML、FEL、SLAC同時(shí)檢測(cè)出來(lái)，故這些正選擇位點(diǎn)被認(rèn)為是強(qiáng)烈的正選擇位點(diǎn)(表6，幾種方法同時(shí)檢測(cè)出的正選擇位點(diǎn)以粗體加波浪線標(biāo)注)。

表6 PcClk基因和PcCry1基因的正選擇位點(diǎn)Table 6 Positive selection sites detection of the PcClk and PcCry1 genes

3 討論

生物鐘是生物體對(duì)地球上環(huán)境因子周期變化長(zhǎng)期適應(yīng)而演變的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制[25]。本研究發(fā)現(xiàn)PcCry1基因的71與213位點(diǎn)受到強(qiáng)烈正選擇作用，該位點(diǎn)位于CLOCK蛋白的PAS結(jié)構(gòu)域中。該功能結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)CLOCK蛋白與另一個(gè)生物鐘基因的二聚體作用，對(duì)晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和維持有一定作用，這與先前對(duì)其他甲殼類動(dòng)物如羅氏沼蝦[26]的研究結(jié)果相似。PcCry1基因的63位點(diǎn)受到強(qiáng)烈正選擇作用，提示克氏原螯蝦可能通過(guò)增強(qiáng)自身的調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境的變化，這與李敬[27]發(fā)現(xiàn)鯨CRY蛋白對(duì)晝夜節(jié)律的調(diào)控有一定作用的研究結(jié)果一致。

迄今關(guān)于甲殼動(dòng)物生物鐘基因表達(dá)的數(shù)據(jù)仍然很少。本研究中，在12 LD光照周期下，溫度升高，腦、眼柄中的PcClk基因和PcCry1基因mRNA表達(dá)增強(qiáng)，節(jié)律性更明顯，但兩個(gè)基因在肝胰腺中的mRNA表達(dá)量減弱，節(jié)律性不明顯。因此，推測(cè)克氏原螯蝦的PcClk基因和PcCry1基因都是由內(nèi)源性節(jié)律驅(qū)動(dòng)。腦作為核心生物鐘調(diào)控元件組織，在生物鐘基因調(diào)控中發(fā)揮中央指揮者的作用，其時(shí)鐘基因mRNA的表達(dá)最先受到調(diào)控;眼柄臨近腦組織，因此時(shí)鐘基因mRNA的表達(dá)相似;而外周組織器官離腦較遠(yuǎn)，所以對(duì)節(jié)律性的保持沒(méi)有腦組織明顯。在對(duì)果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，Clk表達(dá)的節(jié)律性在腦中比在心臟中更明顯[28]，而在豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)和岡比亞瘧蚊(Anophelesgambiae)的研究中，Cry在各自的頭部存在更明顯的節(jié)律性表達(dá)[29]。這與本研究發(fā)現(xiàn)的克氏原螯蝦的生物鐘基因在腦中節(jié)律性更明顯的結(jié)果一致。

在溫度為25℃時(shí)，相對(duì)于24 LL和24 DD的光照周期，12 LD的光照周期下，克氏原螯蝦腦、眼柄、肝胰腺中PcClk基因的mRNA表達(dá)振蕩節(jié)律更明顯；同樣地，在25℃、12 LD培養(yǎng)模式下，腦和眼柄中PcCry1基因的mRNA表達(dá)節(jié)律性也較明顯。這可能是因?yàn)?5℃、12 LD對(duì)克氏原螯蝦來(lái)說(shuō)是適宜的溫度和光照，而適宜的溫度和光暗循環(huán)更有利于克氏原螯蝦PcClk和PcCry1基因節(jié)律性的保持。李龍[30]研究顯示光照的改變對(duì)斑馬魚生物鐘基因的調(diào)控有很大影響；蔡明岐[31]在研究光照和溫度對(duì)蚤狀溞(Daphniapulex)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在25℃且光照和黑暗比為8∶16時(shí)最有利于蚤狀溞生物鐘基因晝夜節(jié)律的保持，也最適合蚤狀溞生長(zhǎng)；徐加元等[32]發(fā)現(xiàn)在適宜的溫度和光照周期下，適當(dāng)延長(zhǎng)光照周期可促進(jìn)克氏原螯蝦雌蝦卵巢的發(fā)育，但過(guò)長(zhǎng)的光照不僅不會(huì)促進(jìn)雌蝦的性腺發(fā)育，反而會(huì)抑制其性腺發(fā)育。適宜的光照和溫度有利于克氏原螯蝦生物鐘基因的調(diào)節(jié)，而生物鐘調(diào)節(jié)的穩(wěn)定對(duì)生物體健康狀況意義重大。本研究中，25℃、12 LD培養(yǎng)模式最有利于克氏原螯蝦PcClk和PcCry1基因節(jié)律性的保持，而生物鐘節(jié)律的穩(wěn)定可以讓克氏原螯蝦保持更穩(wěn)定的健康狀態(tài)。由此可見(jiàn)，在克氏原螯蝦的養(yǎng)殖過(guò)程中選擇合適的溫度和光照尤為重要。

4 結(jié)論

在溫度25℃、12 LD光照周期下，克氏原螯蝦腦中的PcClk和PcCry1的mRNA表達(dá)都呈現(xiàn)出一定的振蕩節(jié)律，說(shuō)明PcClk基因和PcCry1基因是內(nèi)源性的節(jié)律基因。選擇壓力分析顯示，通過(guò)PAML和Datamonkey共同篩選出的PcCLK正選擇位點(diǎn)為71與213，PcCRY1正選擇位點(diǎn)為63。這些位點(diǎn)在節(jié)肢動(dòng)物CLK和CRY1蛋白進(jìn)化中起重要作用，調(diào)控mRNA翻譯過(guò)程和蛋白質(zhì)相互作用，可能參與節(jié)肢動(dòng)物內(nèi)在節(jié)律的調(diào)控。