陳偉鴻，吳琪琪，周越菡

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541199)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的80%左右[1]。近年來，盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤的外科手術(shù)治療、靶向治療與免疫治療等治療方法取得了重大突破，但神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然較差[2,3]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷與治療趨于基因和分子水平，尋找特異性的臨床標(biāo)志物有助于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷和準(zhǔn)確預(yù)后，為個體化治療提供了可能[4]。

鐵死亡是不同于自噬與調(diào)亡的新型細(xì)胞死亡方式，其依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵離子與活性氧含量的變化，引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死[5]。Long non-coding RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸、以缺少或者無開放閱讀框架為特征的RNA分子，是體內(nèi)重要的信號分子，調(diào)控基因的表達(dá)，參與各種生物調(diào)控過程如轉(zhuǎn)錄沉默、染色體修飾等，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[6]。目前，國內(nèi)外對鐵死亡相關(guān)lncRNA的研究較少，有研究表明，LINC00618可以增加鐵離子與活性氧的水平并調(diào)控相關(guān)基因?qū)е履[瘤細(xì)胞鐵死亡，同時改善抗腫瘤藥物的耐藥性，提示鐵死亡相關(guān)lncRNA在腫瘤治療中的重要性[7]。lncRNA可以在外泌體中選擇性地包裝、分泌和在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，且外泌體能夠穿過血腦屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)并調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、侵襲、血管生成、免疫逃逸和治療抵抗等，展現(xiàn)lncRNA作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤新型的生物標(biāo)志物與潛在治療靶點(diǎn)的巨大潛力[8]。然而，通過鐵死亡相關(guān)lncRNA評估神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后與生存率的研究仍較少。

本研究將通過生物信息學(xué)方法，分析從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，借助基因共表達(dá)等方法尋找鐵死亡相關(guān)lncRNA，通過生存分析、獨(dú)立預(yù)后分析、受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic Curve，ROC Curve)、列線圖、基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)等方法，評估鐵死亡相關(guān)lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后中的價值及臨床意義，通過TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS等方法分析免疫浸潤情況，進(jìn)一步對免疫功能、免疫檢查點(diǎn)以及N6-甲基腺苷(m6A)甲基化差異進(jìn)行分析，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的基因治療與靶向治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與篩選鐵死亡相關(guān)lncRNA

從TCGA數(shù)據(jù)庫抽取698名神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，通過FerrDB數(shù)據(jù)庫(http://www.zhounan.org/ferrdb/)獲得目前已知的259個鐵死亡基因，通過基因共表達(dá)的方法計(jì)算鐵死亡基因與lncRNA的關(guān)聯(lián)系數(shù)，根據(jù)|cor|>0.4，P-value<0.05進(jìn)行初步篩選，再通過單因素Cox回歸分析結(jié)果再次篩選，得到預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)lncRNA，根據(jù)LASSO Cox回歸分析與鐵死亡相關(guān)lncRNA的表達(dá)情況計(jì)算每個樣本的風(fēng)險評分，通過cytoscape 3.8.2軟件對上述結(jié)果繪制lncRNA-基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 風(fēng)險評分獨(dú)立預(yù)后分析

將風(fēng)險評分與臨床特征(年齡、性別、疾病分型)進(jìn)行單因素獨(dú)立預(yù)后分析與多因素獨(dú)立預(yù)后分析，通過R軟件繪制森林圖，并通過繪制ROC曲線驗(yàn)證觀察該模型預(yù)測患者生存情況的準(zhǔn)確性，驗(yàn)證獨(dú)立預(yù)后分析結(jié)果，繪制列線圖預(yù)測患者生存率。

1.3 高、低風(fēng)險組生存分析

根據(jù)風(fēng)險得分的中位值將698個樣本分為高風(fēng)險組與低風(fēng)險組，對高、低風(fēng)險組結(jié)合臨床生存數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，通過R軟件繪制生存曲線與風(fēng)險曲線，繪制熱圖，對lncRNA在高、低風(fēng)險組總的表達(dá)情況進(jìn)行可視化。

1.4 高、低風(fēng)險組基因富集分析

對高、低風(fēng)險組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的基因表達(dá)矩陣進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換，通過GSEA 4.1.0軟件對高、低風(fēng)險組進(jìn)行基因富集分析，設(shè)置GSEA分析參數(shù)，得到GSEA結(jié)果后根據(jù)歸一化富集分?jǐn)?shù)(Normalized Enrichment Score,NES)>1、名義上(Nominal,NOM)P<0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,FDR)q<0.25進(jìn)行篩選。

1.5 高、低風(fēng)險組免疫與m6A相關(guān)基因差異分析

從TIMER數(shù)據(jù)庫獲得TCGA數(shù)據(jù)庫免疫浸潤樣本，通過TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL、EPIC等方法，分析包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞在高、低風(fēng)險組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中的免疫浸潤情況，通過R軟件制作熱圖，對高、低風(fēng)險組的免疫浸潤情況進(jìn)行可視化分析，計(jì)算高、低風(fēng)險組免疫功能、免疫檢查點(diǎn)、m6A相關(guān)基因的差異，通過R軟件繪制箱線圖進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵死亡相關(guān)lncRNA的篩選

經(jīng)過初步篩選，通過基因共表達(dá)的方法獲得鐵死亡相關(guān)lncRNA共2 536個，再經(jīng)過單因素Cox回歸分析，共確定14個預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)lncRNA，繪制lncRNA-基因網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，該14個lncRNA(包括AC002116.2、LINC02100、LINC00900、AL441992.1、LINC01426、CYTOR、AP001486.2、LINC01503、MIR4435-2HG、OSMR-AS1、CRNDE、AC022613.1、AL133415.1、WAC-AS1)與94個鐵死亡基因有關(guān)聯(lián)，將這14個lncRNA作為后續(xù)的研究對象，對其在698個膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)情況與LASSO Cox回歸分析結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險評分。

圖1 14個鐵死亡相關(guān)lncRNA-基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 14 ferroptosis-related lncRNA-gene network map

2.2 風(fēng)險評分獨(dú)立預(yù)后分析

風(fēng)險評分與各種臨床特征進(jìn)行單因素、多因素獨(dú)立預(yù)后分析，如圖2(a)、圖2(b)所示，P值均小于0.001，說明風(fēng)險評分結(jié)果可以作為一個獨(dú)立的特征來預(yù)測神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。圖2(c)、圖2(d)的ROC曲線表明，風(fēng)險評分的曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)為0.882，高于年齡、性別、疾病分型這些臨床特征，表明風(fēng)險評分相較于年齡、性別、疾病分型這些臨床特征，更可以預(yù)測患者疾病生存率，且風(fēng)險評分1，2，3 a的ROC曲線中的AUC值均大于0.7，均可以有效預(yù)測患者生存率。根據(jù)以上結(jié)果，如圖2(e)所示，繪制列線圖來預(yù)測臨床中患者的生存率，若為53歲左右的G3期女性高風(fēng)險患者，根據(jù)列線圖可以評分為196分，其對應(yīng)的生存時間小于5 a的概率為0.873，小于3年的概率為0.614，小于1年的概率為0.157，可為臨床中預(yù)測患者的生存率提供參考。

圖2 風(fēng)險評分預(yù)后分析結(jié)果Fig.2 Prognosic analysis results of risk scores

2.3 高、低風(fēng)險組生存分析

根據(jù)風(fēng)險評分的中位值將698個樣本分為高、低風(fēng)險兩組，根據(jù)Kaplan-Meier生存分析，如圖3(a)所示，高風(fēng)險組的生存率顯著低于低風(fēng)險組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時在風(fēng)險曲線圖3(b)中可以看到，698個神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中高風(fēng)險組的患者死亡數(shù)更高，且AC002116.2、LINC02100、LINC00900、AL441992.1、LINC01426、CYTOR、LINC01503、MIR4435-2HG、OSMR-AS1、CRNDE、AC022613.1、AL133415.1在高風(fēng)險組中的表達(dá)相對低風(fēng)險組顯著升高，而AP001486.2、WAC-AS1在低風(fēng)險組的表達(dá)相對高風(fēng)險組顯著升高，且在高、低風(fēng)險組中，年齡和性別均有顯著差異。

圖3 高、低風(fēng)險組生存分析結(jié)果Fig.3 Survival analysis results of high and low risk groups

2.4 高、低風(fēng)險組基因富集分析

高、低風(fēng)險組的GSEA結(jié)果如圖4所示。高風(fēng)險組中同種異體移植排斥、DNA復(fù)制、錯配修復(fù)等較低風(fēng)險組顯著活躍[圖4:(a)-(c)]，而低風(fēng)險組中長時程增強(qiáng)效應(yīng)、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、長時程抑制效應(yīng)等較高風(fēng)險組顯著活躍[圖4:(d)-(f)]。

(a)-(c)上調(diào)前三位；(d)-(f)下調(diào)前三位(a)-(c) The top three up-regulated;(d)-(f) The top three down-regulated圖4 基因富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GSEA

2.5 高、低風(fēng)險組免疫及m6A相關(guān)基因的差異

基于TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL、EPIC等方法，高、低風(fēng)險組的免疫浸潤如圖5所示，在免疫功能上高、低風(fēng)險組的免疫檢查點(diǎn)(Check-point)、趨化因子受體(C-C Chemokine Receptor，CCR)、人類白細(xì)胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)等均具有顯著差異，考慮高、低風(fēng)險組在免疫檢查點(diǎn)上有顯著差異，對免疫檢查點(diǎn)作進(jìn)一步分析，可以觀察到免疫檢查點(diǎn)PDCD-1(即PD-1)、CD44、CTLA4等在高、低風(fēng)險組均具有顯著差異，且大部分的免疫檢查點(diǎn)在高風(fēng)險組中顯著高于低風(fēng)險組。m6A相關(guān)基因FTO、ALKBH5、METTL14、METTL3、HNRNPC、WTAP、YTHDF2、RBM15、YTHDC1、YTHDF1、ZC3H13、YTHDC2的表達(dá)在高、低風(fēng)險組中也具有顯著差異。

圖5 高、低風(fēng)險組免疫及m6A相關(guān)基因的差異Fig.5 Differences of immunity and m6A related genes in the high and low risk groups

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種惡性程度極高、侵襲性極強(qiáng)的惡性腫瘤，目前的治療手段仍無法根治，且不同的患者其預(yù)后也不相同。隨著腫瘤的基因治療與免疫治療的不斷發(fā)展，目前迫切需要尋找新的生物標(biāo)志物協(xié)助臨床醫(yī)生完善神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療方案。生物信息學(xué)是信息技術(shù)與生物醫(yī)藥交叉融合發(fā)展的學(xué)科，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究其生物過程[9]，同時可預(yù)測有效的治療靶點(diǎn)，指導(dǎo)疾病的診斷、治療、預(yù)后等，對藥物的研發(fā)、個體化治療有重大意義[10]。

腫瘤研究的主要挑戰(zhàn)之一是如何有效殺死腫瘤細(xì)胞，同時不影響正常細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞為了促進(jìn)生長，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)鐵的需求增加，這種鐵依賴性的特性會使腫瘤細(xì)胞更容易受到鐵催化的壞死，引起腫瘤細(xì)胞鐵死亡，同時增敏化學(xué)治療藥物，減少耐藥，提示鐵死亡作用機(jī)制在治療腫瘤領(lǐng)域的巨大潛力[11]。lncRNA雖然不編碼蛋白質(zhì)，但是在生物體內(nèi)可以與某些miRNA結(jié)合，作為競爭內(nèi)源性RNA調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與生物體內(nèi)各項(xiàng)生物過程[12]。近年來，有研究報道lncRNA可以通過影響鐵死亡相關(guān)的p53信號通路，抑制鐵死亡相關(guān)基因SLC7A11的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[13]，進(jìn)一步表明lncRNA對調(diào)控腫瘤細(xì)胞鐵死亡有重要作用。lncRNA在多種癌癥診斷、預(yù)后與治療中有非常重要的意義，有研究表明lncRNA與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的腫瘤大小、WHO分級和預(yù)后相關(guān)，并且提出lncRNA可以作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床診斷、治療和預(yù)后的潛在分子生物標(biāo)志物[14]。因此，本研究旨在研究鐵死亡相關(guān)lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后中的價值及臨床意義。

本研究通過生物信息學(xué)的分析方法共篩選出14個鐵死亡相關(guān)lncRNA，包括AC002116.2、LINC02100、LINC00900、AL441992.1、LINC01426、CYTOR、AP001486.2、LINC01503、MIR4435-2HG、OSMR-AS1、CRNDE、AC022613.1、AL133415.1、WAC-AS1，它們在高、低風(fēng)險組中的表達(dá)均有差異。除AP001486.2、WAC-AS1外，其余12個lncRNA在高風(fēng)險組中的表達(dá)顯著高于低風(fēng)險組。已有研究表明CRNDE、CYTOR可作為腫瘤患者的預(yù)后生物標(biāo)志物[15,16]，本研究結(jié)果與現(xiàn)有研究結(jié)果相符，證明通過生物信息學(xué)方法篩選出的14個lncRNA作為預(yù)后生物標(biāo)志物的可靠性。

為了進(jìn)一步探討篩選出來的14個lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中預(yù)后的臨床意義，本研究通過單因素與多因素Cox分析，得到的風(fēng)險評分可作為獨(dú)立的預(yù)后因子，與年齡、疾病分型相同，可以評估患者預(yù)后情況，ROC曲線驗(yàn)證獨(dú)立預(yù)后分析的結(jié)果，同時繪制列線圖可預(yù)測臨床中神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存率。Kaplan-Meier生存曲線與風(fēng)險曲線進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出來的14個lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中的預(yù)后價值，高風(fēng)險組的患者表現(xiàn)出較低的生存率，低風(fēng)險組的患者表現(xiàn)出較高的生存率，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后通過基因富集分析，研究高、低風(fēng)險組的患者其生物學(xué)功能與相關(guān)信號通路的差異，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組中同種異體移植排斥、DNA復(fù)制、錯配修復(fù)等顯著活躍，而低風(fēng)險組磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)顯著活躍?？紤]到磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)涉及廣泛的細(xì)胞過程，包括生長、代謝、分化、增殖等，且與免疫細(xì)胞的正常功能和分化有著重要關(guān)系[17]，本研究進(jìn)一步對高、低風(fēng)險組患者中免疫相關(guān)的差異進(jìn)行分析。

腫瘤浸潤免疫細(xì)胞是促進(jìn)和調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和生長的復(fù)雜微環(huán)境的重要部分，影響著腫瘤的診斷、生存和臨床治療敏感性等，近年來在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中浸潤免疫細(xì)胞取得了重要進(jìn)展，有研究表明巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(特別是T細(xì)胞和NK細(xì)胞，以及較少見的B細(xì)胞)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的浸潤程度顯著[18]。本研究通過不同的免疫浸潤分析方法分析高、低風(fēng)險組的免疫浸潤情況，高風(fēng)險組的免疫浸潤程度較低風(fēng)險組顯著。進(jìn)一步對高、低風(fēng)險組的免疫功能進(jìn)行比較，高風(fēng)險組的免疫檢查點(diǎn)(Check-point)、趨化因子受體(CCR)、人類白細(xì)胞抗原(HLA)等免疫功能均顯著高于低風(fēng)險組，考慮到高、低風(fēng)險組存在顯著差異，且近年來免疫檢查點(diǎn)抑制劑對腫瘤治療的重要性，本研究進(jìn)一步分析高、低風(fēng)險組免疫檢查點(diǎn)的差異。

免疫檢查點(diǎn)是在免疫應(yīng)答過程中，調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體抗原識別的共刺激或者抑制信號，在正常生理?xiàng)l件下，免疫檢查點(diǎn)可以調(diào)節(jié)免疫功能，防止機(jī)體免疫功能過度活化，避免自身免疫性疾病的發(fā)生。但免疫檢查點(diǎn)過度表達(dá)時，免疫功能就會受到抑制；反之，當(dāng)免疫檢查點(diǎn)表達(dá)下降時，機(jī)體的免疫功能也會異常。腫瘤細(xì)胞可以影響免疫檢查點(diǎn)，使得抗原不能有效被提呈，機(jī)體免疫功能不能被有效激活，從而抑制免疫細(xì)胞的功能，起到免疫逃逸的作用[19]。目前,臨床中已出現(xiàn)取得較好治療效果的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如PD-1單克隆抗體、CTLA-4抗體等，可以解除腫瘤細(xì)胞對免疫檢查點(diǎn)的作用，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，有效殺傷腫瘤細(xì)胞[20]。通過對高、低風(fēng)險組免疫檢查點(diǎn)的差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PDCD-1(即PD-1)、CD44、CTLA-4等均有顯著差異，且高風(fēng)險組中大部分的免疫檢查點(diǎn)顯著高于低風(fēng)險組。

RNA甲基化是一種可逆的RNA轉(zhuǎn)錄后修飾，對許多生物過程有重大的影響。m6A被認(rèn)為是最常見的真核細(xì)胞mRNA甲基化修飾類型之一，存在于多種生物體中。m6A甲基化在大腦的不同發(fā)育階段控制神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育及其向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞(如少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)的分化[21]。有研究表明，m6A修飾可以通過多種機(jī)制在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為膠質(zhì)瘤的早期診斷、靶向治療、改善患者預(yù)后提供更多可能，具有重要的臨床意義[22]。因此,本研究對高、低風(fēng)險組中m6A甲基化相關(guān)基因的差異作進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)高、低風(fēng)險組中FTO、ALKBH5、METTL14、METTL3、HNRNPC、WTAP、YTHDF2、RBM15、YTHDC1、YTHDF1、ZC3H13、YTHDC2均有顯著差異，提示靶向上述基因m6A甲基化的基因治療可為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新策略。

4 結(jié)論

根據(jù)篩選出的14個鐵死亡相關(guān)lncRNA在樣本中的表達(dá)情況與LASSO Cox回歸分析結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險評分，將樣本分為高風(fēng)險組與低風(fēng)險組，高、低風(fēng)險組的生存曲線、風(fēng)險曲線等均具有顯著差異，風(fēng)險評分結(jié)果可作為獨(dú)立預(yù)后因素，提示上述鐵死亡相關(guān)lncRNA可以作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤新的生物標(biāo)志分子。此外，本研究對高、低風(fēng)險組免疫浸潤、免疫功能、免疫檢查點(diǎn)、m6A甲基化的差異進(jìn)行了探討，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的基因治療與免疫治療提供了有價值的參考。