劉丹丹，王 鶴，高文靜

(沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110142)

柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞菌柑橘亞種(Xanthomonascitrisubsp.citri)引起的影響全球柑橘種植產(chǎn)業(yè)的細(xì)菌性潰瘍病[1-3]。柑橘潰瘍病會(huì)影響柑橘的生產(chǎn)，從而導(dǎo)致產(chǎn)量損失、果實(shí)質(zhì)量下降和貿(mào)易壁壘[4]。近年來(lái),中國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，栽培面積和年產(chǎn)量已超過(guò)美國(guó)和巴西，成為世界第一大柑橘生產(chǎn)國(guó)。中國(guó)各主要柑橘產(chǎn)區(qū)幾乎皆有柑橘潰瘍病發(fā)生，對(duì)柑橘尤其是橙類產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[5]。目前田間常用的防治藥劑主要有銅制劑、農(nóng)用抗生素、噻唑類和微生物制劑等。其中銅制劑因殺菌效果顯著，作用時(shí)間長(zhǎng)，成為防治柑橘潰瘍病的首選藥劑。但銅制劑的過(guò)度使用會(huì)造成潰瘍病菌抗性增強(qiáng)，同時(shí)會(huì)造成環(huán)境污染，從而導(dǎo)致防治難度加大[5,6]；抗生素類藥劑的長(zhǎng)期施用會(huì)在人體內(nèi)不斷蓄積，對(duì)人體肝腎、淋巴細(xì)胞等造成傷害，還會(huì)危害農(nóng)作物的生長(zhǎng)，對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，降低微生物的多樣性和活性，并產(chǎn)生抗生素抗性基因，抗生素的肆意使用已導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性甚至產(chǎn)生超級(jí)細(xì)菌[7,8]；噻唑類化合物會(huì)引起人體眼睛、皮膚和呼吸道刺激等，甚至?xí)?duì)人體產(chǎn)生致癌作用[9]。因此，防治藥劑的減量化施用，減小防治藥劑對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的污染，具有重要的意義。韋文添等[10]研究表明，“唑酮·乙蒜素”和“春雷霉素”的防效達(dá)90%以上；趙洪濤等[11]研究表明，200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑和1.6%噻霉酮涂抹劑對(duì)沃柑潰瘍病有較好的防治效果，防效分別為73.45%和71.07%。雖然前人已經(jīng)對(duì)柑橘潰瘍病的化學(xué)防治防效進(jìn)行了研究，但針對(duì)防治藥劑減量化施用，防止藥劑濫用的研究卻鮮有報(bào)道。本研究對(duì)病原菌純化分離，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行系統(tǒng)性鑒定。通過(guò)渾濁度法測(cè)定不同防治藥劑對(duì)病原菌的毒力，采用分光光度法測(cè)定病原菌在防治藥劑作用下的生長(zhǎng)變化情況，探究防治藥劑的聯(lián)合施用方式，旨在為柑橘潰瘍病的防治及防治藥劑減量化施用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥劑

銅類：20%噻菌銅懸浮劑(浙江龍灣化工有限公司)、20%松脂酸銅懸浮劑(青島中達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司)，農(nóng)用抗生素類：12%中生菌素可濕性粉劑(福建凱立生物制品有限公司)，生物制劑：0.5%靚果安水劑(河北萬(wàn)特生物化學(xué)有限公司)、80%乙蒜素乳油(開(kāi)封大地農(nóng)化生物科技有限公司)，銅鋅制劑：78%波爾·錳鋅可濕性粉劑(美國(guó)仙農(nóng)有限公司)。

1.2 病原菌分離及生物學(xué)特征

1.2.1 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察

柑橘潰瘍病病葉來(lái)自廣西南寧市武鳴區(qū)雙橋鎮(zhèn)下淥村不同果園的沃柑果樹(shù)。剪取病健交界處的組織，用75%乙醇消毒30 s，再用無(wú)菌水清洗3次后，將消毒后的葉片置于裝有無(wú)菌水的離心管中搗碎。然后用接種環(huán)蘸取菌懸液，采用平板劃線法在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離后，置于恒溫培養(yǎng)箱中，30℃條件下倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落分離純化培養(yǎng)，觀察平板上的菌落形態(tài)，將病原菌梯度酒精脫水、冷凍干燥、噴金后通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)[11,12]。

1.2.2 生理生化特征

生理生化特征鑒定實(shí)驗(yàn)方法參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]。

1.2.3 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

將病原菌用無(wú)菌水配置成1×107CFU/mL濃度的菌懸液，接種100 μL菌懸液于100 mL NB培養(yǎng)基中，分別將各NB培養(yǎng)基置于21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃，120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后，在600 nm處測(cè)定其吸光度，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。

1.2.4 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

用磷酸鹽緩沖液將NB液體培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.00，6.00，7.00，8.00，9.00，10.00。將100 μL菌懸液接入100 mL pH值不同的培養(yǎng)基中，在30℃、120 r/min條件下培養(yǎng)48 h后測(cè)定其吸光度，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。

1.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

合成3對(duì)柑橘潰瘍病菌特異性引物以及1對(duì)通用引物(表1)(引物1/引物2和引物3/引物4為柑橘潰瘍病菌A菌系特異性引物，引物5/引物6為柑橘潰瘍病菌致病因子pthA特異性引物，引物7/引物8為通用引物)對(duì)純化菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用CTAB法提取病原菌DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序如下：DNA 2 μL、Premix Taq 25 μL、上下游引物各2.5 μL、用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μL；94℃預(yù)變性5 min后，以94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

表1 PCR特異性引物Table 1 PCR specific primers

1.4 不同防治藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

1.4.1 藥劑配置

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定各防治藥劑的抑菌濃度范圍，將20%噻菌銅懸浮劑稀釋成4 000 μg/mL、3 000 μg/mL、2 500 μg/mL、2 000 μg/mL、1 500 μg/mL溶液；將20%松脂酸銅懸浮劑稀釋成4 000 μg/mL、3 000 μg/mL、2 000 μg/mL、1 500 μg/mL、750 μg/mL溶液；將12%中生菌素可濕性粉劑稀釋成4 000 μg/mL、3 000 μg/mL、2 000 μg/mL、1 500 μg/mL、1 000 μg/mL溶液；將0.5%靚果安水劑稀釋成0.800 μg/mL、0.500 μg/mL、0.250 μg/mL、0.200 μg/mL、0.125 μg/mL溶液；將80%乙蒜素乳油稀釋成40 μg/mL、30 μg/mL、20 μg/mL、15 μg/mL、10 μg/mL溶液；將78%波爾·錳鋅可濕性粉劑稀釋成780 μg/mL、520 μg/mL、390 μg/mL、260 μg/mL、195 μg/mL溶液。

1.4.2 防治藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定

用渾濁度法[19,20]測(cè)定柑橘潰瘍病菌對(duì)防治藥劑的敏感性。在100 mL NB培養(yǎng)基中分別加入1.4.1節(jié)中配置的藥劑，以不含藥培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。在配置好的培養(yǎng)基中均加入100 μL菌懸液，置于30℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。待對(duì)照處理到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，測(cè)定并記錄各處理的渾濁度，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，利用SPSS軟件對(duì)藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值和防效幾率值進(jìn)行回歸分析，求得各防治藥劑的毒力回歸方程及半數(shù)有效濃度(EC50)。

1.5 病原菌在防治藥劑作用下的生長(zhǎng)變化

將防治藥劑分別稀釋至半數(shù)有效濃度，取1 mL加入100 mL NB液體培養(yǎng)基中，設(shè)不含藥培養(yǎng)基為空白對(duì)照，接入100 μL菌液后置于30℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。每12 h測(cè)定1次吸光度，觀察細(xì)菌96 h內(nèi)的生長(zhǎng)變化情況。

1.6 80%乙蒜素乳油與0.5%靚果安水劑的聯(lián)合防治

在100mL NB培養(yǎng)基中加入1 mL 0.41 μg/mL 0.5%靚果安水劑，接入100 μL菌液后置于30℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，再加入1 mL 32.0 μg/mL 80%乙蒜素乳油，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)，觀察其96 h內(nèi)吸光度的變化情況。

在100 mL NB培養(yǎng)基中同時(shí)加入等質(zhì)量濃度的0.5%靚果安水劑和80%乙蒜素乳油，置于30℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，觀察其96 h內(nèi)吸光度的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌生物學(xué)特征

2.1.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征

觀察菌株在電子顯微鏡下和在NA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，該菌為黃色長(zhǎng)桿菌，菌落呈圓形，黃色，全緣，表面光滑，有光澤，微隆起，黏稠，與之前報(bào)道的柑橘潰瘍病菌相似[11,21](圖1)。

(a)電子顯微鏡(×20 000)下細(xì)菌形態(tài)；(b)平板上菌落形態(tài)(a) Bacterial morphology under electron microscope (×20 000)；(b) Colony morphology on medium圖1 病原菌形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of pathogens

2.1.2 生理生化特征

經(jīng)過(guò)生理生化特征分析，發(fā)現(xiàn)病原菌革蘭氏染色結(jié)果、M-R試驗(yàn)、硝酸鹽實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)呈陰性，V-P試驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶呈陽(yáng)性，病原菌能水解明膠、淀粉和七葉苷，與Xanthomonas的生理生化特性基本一致。

2.2 溫度和pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

在21-30℃，OD600值隨著溫度升高逐漸增加，細(xì)菌生長(zhǎng)速率變快；在30-36℃，OD600值隨著溫度升高逐漸增加，細(xì)菌生長(zhǎng)速率受到抑制；30℃時(shí)OD600值最大，為病原菌最適宜生長(zhǎng)溫度；pH值在5.00-7.00，OD600值隨著pH值增大而增加；pH值在7.00-10.00，OD600值隨著pH值增大而減??；pH值為7.00時(shí)OD600值最大，為病原菌最適合生長(zhǎng)pH值。綜上，溫度為30℃、pH值為7.00為病原菌最適宜生長(zhǎng)條件(表2、表3)。

表2 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of temperature on the growth of pathogens

表3 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of pH on the growth of pathogens

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

利用引物1/引物2、引物3/引物4、引物5/引物6以及細(xì)菌16S rDNA通用引物7/引物8檢測(cè)病原菌DNA(圖2)并結(jié)合測(cè)序結(jié)果，分別得到符合預(yù)期大小的197 bp、413 bp、582 bp和1 060 bp的目的條帶。將PCR產(chǎn)物測(cè)序后得到的序列在Genbank中進(jìn)行Nucleotide BLAST分析。結(jié)果顯示，引物1/引物2擴(kuò)增的序列與X.citrisubsp.citristrain Xcc49(登錄號(hào)CP024 030.1)相似度為98.96%；引物3/引物4擴(kuò)增的序列與X.citrisubsp.citristrain Xcc49(登錄號(hào)CP023 662.1)相似度為98.81%；引物5/引物6 擴(kuò)增的序列與X.citrisubsp.citristrain Xcc49(登錄號(hào)CP023 662.1)相似度為99.81%，引物7/引物8擴(kuò)增的序列與X.axonopodisstrain THKL1(登錄號(hào)MT328 603.1)相似度為99.81%。結(jié)合4對(duì)不同引物的擴(kuò)增結(jié)果，證明病原菌為柑橘潰瘍病菌(X.citrisubsp.citri)，A菌系。

2.4 防治藥劑毒力測(cè)定結(jié)果

從表4可知，20%噻菌銅懸浮劑、20%松脂酸銅懸浮劑、78%波爾·錳鋅可濕性粉劑、12%中生菌素可濕性粉劑、80%乙蒜素乳油、0.5%靚果安水劑的EC50值從大到小依次為26.60 μg/mL、18.80 μg/mL、3.39 μg/mL、3.01 μg/mL、0.32 μg/mL、0.004 1 μg/mL。0.5%靚果安水劑EC50值最小，防治效果最佳。

1，2，3，4，M依次代表引物1/引物2、引物3/引物4、引物5/引物6、引物7/引物8及DNA Marker1,2,3,4,M represent primer 1/ primer 2,primer 3/ primer 4,primer 5/ primer 6,primer 7/ primer 8 and DNA Marker圖2 特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification with specific primers

表4 防治藥劑對(duì)柑橘潰瘍病菌的毒力測(cè)定Table 4 Toxicity determination of bactericide X.citri subsp.citri against citrus canker

2.5 柑橘潰瘍病菌在防治藥劑作用下生長(zhǎng)變化

由圖3可知，36 h時(shí)，OD600值依次為20%噻菌銅懸浮劑>20%松脂酸銅懸浮劑>78%波爾·錳鋅可濕性粉劑>12%中生菌素可濕性粉劑>80%乙蒜素乳油>0.5%靚果安水劑；48 h時(shí)，OD600值依次為20%噻菌銅懸浮劑>20%松脂酸銅懸浮劑>80%乙蒜素乳油>78%波爾錳鋅可濕性粉劑>12%中生菌素可濕性粉劑>0.5%靚果安水劑；60-72 h，OD600值依次為20%噻菌銅懸浮劑>20%松脂酸銅懸浮劑>0.5%靚果安水劑>12%中生菌素可濕性粉劑>78%波爾錳鋅可濕性粉劑>80%乙蒜素乳油；84 h后，只有80%乙蒜素乳油表現(xiàn)出明顯的防治效果。

圖3 柑橘潰瘍病菌在不同防治藥劑EC50值下的生長(zhǎng)變化Fig.3 Growth changes of X.citri subsp.citri under different bactericides EC50 values

2.6 0.5%靚果安水劑和80%乙蒜素乳油的聯(lián)合防治

由圖4可知，在48 h時(shí)加入80%乙蒜素乳油后，OD600值變化明顯低于單一藥劑；先施用0.5%靚果安水劑，后施用80%乙蒜素乳油的防治效果在72 h前略低于同時(shí)加入兩種藥劑的防治效果；72-96 h先施用0.5%靚果安水劑，后施用80%乙蒜素乳油的防治效果略高于同時(shí)加入兩種藥劑。

圖4 聯(lián)合防治下柑橘潰瘍病菌的生長(zhǎng)變化Fig.4 Growth changes of X.citri subsp.citri under combined control

3 討論

研究表明，根據(jù)地理分布和對(duì)寄主植物的致病性差異將柑橘潰瘍病菌分為A、B、C、D、E 5個(gè)菌系。其中，致病力最強(qiáng)的亞洲菌系為A菌系；B、C、D、E菌系分別發(fā)現(xiàn)于南美洲、巴西、墨西哥和美國(guó)佛羅里達(dá)州[5]。根據(jù)16s rDNA測(cè)序的差異，又將柑橘潰瘍病菌分為3個(gè)亞種，即柑橘黃單胞柑橘亞種(X.citrisubsp.citri，Xcc)、棕色黃單胞萊檬亞種(X.fuscanssubsp.aurantifolii，Xfa)和苜蓿黃單胞枳柚亞種(X.alfalfaesubsp.citrumelonis，Xac)。其中，柑橘黃單胞柑橘亞種為原A菌系和地毯黃單胞柑橘亞種(X.axonopodissubsp.citri)[22]。本研究結(jié)合病原菌生物學(xué)觀察、生理生化特征和16 s rDNA鑒定確定分離出的病原菌為株柑橘黃單胞柑橘亞種A菌系，是中國(guó)柑橘潰瘍病菌的主要類型，與趙洪濤等[11]的研究結(jié)果一致。

室內(nèi)毒力是衡量藥劑對(duì)有害生物毒力作用大小的指標(biāo)之一[11]。本研究中防治藥劑毒力測(cè)定結(jié)果表明，6種供試防治藥劑中0.5%靚果安水劑的EC50值最小，為0.004 1 μg/mL，對(duì)柑橘潰瘍病菌的防治效果更強(qiáng)；80%乙蒜素乳油次之；EC50值較大的是20%松脂酸銅懸浮劑和20%噻菌銅懸浮劑兩種銅制劑，分別為18.80 μg/mL和26.60 μg/mL。覃旭[23]發(fā)現(xiàn)在14種藥劑中，甲霜·錳鋅對(duì)柑橘潰瘍病菌的最小抑制濃度為0.039 1 mg/mL，抑菌效果最強(qiáng)；余沁涵[24]實(shí)驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌的EC50值為5.28 g/L，抑菌活性更強(qiáng)，且對(duì)環(huán)境破壞較?。凰螘员萚25]研究發(fā)現(xiàn)噻霉酮和氫氧化銅在室內(nèi)毒力測(cè)定及田間施用試驗(yàn)中均具有較好的抑菌水平。此外，唑酮·乙蒜素等[10]防治藥劑也具有較強(qiáng)的抑制柑橘潰瘍病生長(zhǎng)的作用，對(duì)柑橘潰瘍病的防治有著重要的參考意義。為了進(jìn)一步探究柑橘潰瘍病菌防治藥劑減量化施用，通過(guò)不同類型防治藥劑的防治效果動(dòng)態(tài)變化可以看出，48 h之前施用0.5%靚果安水劑防治效果更佳，80%乙蒜素乳油在48-96 h內(nèi)防治效果更為顯著。將兩種防治藥劑按順序施用后，防治效果明顯優(yōu)于單一藥劑，且在72 h前略低于同時(shí)加入兩種藥劑的防治效果，72 h后略高于同時(shí)加入兩種藥劑的防治效果，推斷同時(shí)加入兩種藥劑處理72 h后80%乙蒜素乳油藥效降低，需重新施加藥劑。由于田間施用防治藥劑的連續(xù)性，同時(shí)施加藥劑會(huì)導(dǎo)致72 h后80%乙蒜素乳油藥效降低，如果重新施加藥劑，就會(huì)增加藥劑的施用量，從而造成污染，因此本研究認(rèn)為優(yōu)先施用0.5%靚果安水劑，48 h后再施用80%乙蒜素乳油，120 h后重新施用0.5%靚果安水劑的施藥方式更有利于實(shí)現(xiàn)防治藥劑減量化。

已有研究表明，防治藥劑的使用除少部分作用于目標(biāo)病蟲(chóng)害外，其余大部分流失于土壤、水體和大氣中，致使耕地和周邊環(huán)境受到不同程度的污染，造成農(nóng)藥殘留污染的農(nóng)作物面積將近100%[26]。但在相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)期內(nèi)，化學(xué)防治依然是防治農(nóng)作物病蟲(chóng)害、減少產(chǎn)量損失的重要手段。近年來(lái)，通過(guò)改良施藥方式[27]、復(fù)配施藥[28,29]、添加輔助藥劑[30]等多種防治藥劑減量化方式，對(duì)水稻、玉米等作物的相關(guān)病害進(jìn)行防控，實(shí)現(xiàn)降低污染、穩(wěn)產(chǎn)增效的目標(biāo)，因此探究防治藥劑減量化方式將成為未來(lái)防治病蟲(chóng)害的發(fā)展趨勢(shì)之一。

柑橘潰瘍病一年有3個(gè)發(fā)病高峰期，春梢發(fā)病高峰在5月上中旬，夏梢發(fā)病高峰在6月中下旬，秋梢發(fā)病高峰在9月下旬至10月初，以6-7月的夏梢和晚夏梢受害最重，在發(fā)病高峰期采用輪流施藥的方式，既可以有效防治柑橘潰瘍病的發(fā)生，又可以減少防治藥劑對(duì)土壤等環(huán)境的污染，降低對(duì)人體的危害，更符合綠色農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)的要求,對(duì)合理施用化學(xué)藥劑防治病害具有現(xiàn)實(shí)意義。