陳萬(wàn)松，熊 偉，熊 書

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶 404120)

肝癌是一種發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，具有極高的死亡率。目前，治療肝癌主要有手術(shù)治療、化療、放療、中藥治療和生物治療等方法，其中手術(shù)治療、放療、化療效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不盡人意。中藥治療可以改善患者體征，減輕放化療的毒副作用，提高生存率和生存質(zhì)量。貝母是貝母屬植物的鱗莖，干燥入藥，是川產(chǎn)道地貴細(xì)藥材之一，因其獨(dú)特的化痰止咳、清熱潤(rùn)肺和散結(jié)消癰效果而馳名。貝母的主要活性單體為皂苷、糖苷、甾體生物堿和萜類等[1]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，貝母中的生物堿貝母素甲具有抗腫瘤活性，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2-3]。綜合結(jié)果表明，貝母素甲可作為一種全新的抗癌候選藥物，但是貝母素甲對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制活性尚未見報(bào)道。通過(guò)研究貝母中貝母素甲抑制肝癌細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)及相關(guān)機(jī)制，以期為后續(xù)應(yīng)用于臨床提供可靠的藥理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

A組：含1 μmol/L貝母素甲的培養(yǎng)基；B組：含2.5 μmol/L貝母素甲的培養(yǎng)基；C組：含5 μmol/L貝母素甲的培養(yǎng)基；D組：含7.5 μmol/L貝母素甲的培養(yǎng)基；E組：含10 μmol/L貝母素甲的培養(yǎng)基。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn))；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司生產(chǎn))；多孔酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-RAD公司生產(chǎn))；流式細(xì)胞儀(美國(guó)B D公司生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT法評(píng)價(jià)貝母素甲對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖的影響

96孔板培養(yǎng)HepG 2細(xì)胞24 h后去培養(yǎng)基，A、B、C、D和E組每孔分別加入含不同濃度的貝母素甲培養(yǎng)基100 μL，對(duì)照組每孔加入不含貝母素甲的培養(yǎng)基100 μL，空白組每孔只加不含細(xì)胞與貝母素甲的培養(yǎng)基100 μL，每個(gè)組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。接種完畢后，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，棄上清，每孔再加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃、5% CO2孵育4 h。每孔再加入三聯(lián)液100 μL，37℃混勻后過(guò)夜放置。將藍(lán)紫色產(chǎn)物formazan溶解，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定吸光度值。

1.3.2 貝母素甲對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞周期的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG 2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%融合，置于無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)4 h，再分別加入含1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L的貝母素甲培養(yǎng)基處理72 h，以未加藥物處理的組為對(duì)照組。HepG 2細(xì)胞離心后，70%乙醇固定殺死細(xì)胞，4℃下放置4 h，加入RNaseA去除RNA，37℃水浴30 min，加入800 μL PI染色液，流式細(xì)胞儀488 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

1.3.3 貝母素甲對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞凋亡的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG 2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%融合，更換無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4 h，再分別加入含1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L的貝母素甲培養(yǎng)基處理72 h，以未加藥物處理的組為對(duì)照組。根據(jù)Annexin V-PI 凋亡試劑盒操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 體外MTT法評(píng)價(jià)貝母素甲對(duì)肝癌細(xì)胞HepG 2增殖的影響

貝母素甲對(duì)HepG 2細(xì)胞的影響見表1。結(jié)果顯示：藥物刺激后，C、D和E組與對(duì)照組相比有明顯差異；隨著貝母素甲濃度的增大，其對(duì)細(xì)胞的抑制作用逐漸加強(qiáng)，提示高濃度的貝母素甲對(duì)HepG 2細(xì)胞有一定的毒性作用。除此之外，藥物處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)肝癌細(xì)胞的影響越大。

表1 不同濃度貝母素甲對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effects of different concentrations of Peimine on proliferation of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

2.2 貝母素甲對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞周期的影響

經(jīng)過(guò)定量分析的結(jié)果顯示，1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L貝母素甲3個(gè)處理組細(xì)胞周期分布與對(duì)照組相比，G0G1期與S期均沒(méi)有明顯改變(P>0.05)，7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲處理組細(xì)胞G0G1期占比顯著多于對(duì)照組(60.83±3.50%，63.53±2.43% vs 49.86±3.50%，P<0.05)而7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲處理組處于S期的占比顯著少于對(duì)照組(表2)。表明≥7.5 μmol/L貝母素甲處理HepG 2細(xì)胞使G0G1占比增加，表明細(xì)胞被阻滯在G0G1期，進(jìn)而使細(xì)胞的分裂被阻止。

2.3 貝母素甲對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞凋亡的影響

早期凋亡分析發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲早期凋亡百分比依次增大。晚期凋亡分析表明，對(duì)照組、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲組晚期凋亡百分比依次增大，從2.5 μmol/L貝母素甲組開始后的4組早期凋亡百分比均與1 μmol/L貝母素甲和對(duì)照組有顯著性差異，說(shuō)明貝母素甲濃度的增大會(huì)增加細(xì)胞的早期凋亡(表3)。晚期凋亡中，7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲與前面幾組有顯著性差異，說(shuō)明≥10 μmol/L貝母素甲出現(xiàn)較強(qiáng)的毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。

表2 不同濃度貝母素甲對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞周期的影響Tab.2 Effects of different concentrations of Peimine on cycle of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

表3 不同濃度貝母素甲對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞凋亡的影響Tab.3 Effects of different concentrations of Peimine on apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

3 討論

1983年，Mosmann創(chuàng)立了MTT比色法并第一次應(yīng)用IL-2等細(xì)胞因子處理大鼠淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞并研究對(duì)其增殖的影響[4]，隨后迅速推廣，廣泛用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[5]。貝母素甲是一種生物堿，對(duì)肺癌細(xì)胞有所抑制，但是對(duì)于肝癌細(xì)胞暫未有所記載。研究貝母素甲對(duì)HepG 2細(xì)胞增殖的影響，不僅能為臨床上溫和的方式治療肝癌有所幫助和補(bǔ)充，還能夠?yàn)檠芯科鋵?duì)HepG 2細(xì)胞周期、凋亡、遷移等方面作濃度參考。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度的貝母素甲對(duì)HepG 2細(xì)胞有一定的毒性作用。

G0/G1期是細(xì)胞分裂的重要時(shí)期，當(dāng)G0/G1期細(xì)胞占比降低，則處于細(xì)胞分裂期的細(xì)胞降低，從而引起S期和G2/M期細(xì)胞的數(shù)量降低，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯或延長(zhǎng)，DNA合成不足，影響細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、增殖等，最終誘發(fā)凋亡機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，貝母素甲使HepG 2細(xì)胞周期阻滯在G0G1期，從而阻止細(xì)胞分裂。

Annexin V/PI雙染法是一種常見的細(xì)胞凋亡熒光檢測(cè)方法。Annexin V與磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)有較強(qiáng)的親和力，但PS存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，只有在細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí)才會(huì)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，Annexin V能與外翻的PS結(jié)合[6]。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一種核酸染料，只有在細(xì)胞凋亡晚期和細(xì)胞壞死時(shí)才能進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞核染色。Annexin V是早期反應(yīng)而PI 是晚期反應(yīng)，因此兩者結(jié)合使用可區(qū)分不同時(shí)期的凋亡現(xiàn)象。結(jié)果表明，貝母素甲誘導(dǎo)HepG 2細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。