董蘭芳, 許明珠, 劉海娟, 曾夢(mèng)清, 陳瑞芳, 李世才

廣西海水養(yǎng)殖新品種繁育工程技術(shù)研究中心(廣西海洋研究所有限責(zé)任公司), 廣西 北海 536000

鱟(Limulus)屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Archropoda), 肢口綱(Merostomata), 劍尾目(Xiphosura), 鱟科(Limulidae), 是一種生活在海洋中的大型節(jié)肢動(dòng)物。鱟出現(xiàn)在地質(zhì)歷史時(shí)期古生代的泥盆紀(jì), 由三葉蟲(chóng)演化而來(lái), 是地球上少數(shù)僅存的古老物種, 經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的歲月, 保留了原始而古老的形態(tài)特征, 有海中“活化石”之稱(chēng)。中國(guó)鱟(Tachypleus tridentatus)是東方鱟屬中的一種(Sekiguchi, 1988)。世界上95%的中國(guó)鱟資源分布在中國(guó), 尤其廣西北部灣是中國(guó)鱟最主要的棲息地(李瓊珍, 2010)。由于近二十年的過(guò)度捕撈和沿海灘涂開(kāi)發(fā)破壞, 中國(guó)鱟資源急劇減少,已成為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。我國(guó)有關(guān)部門(mén)一直重視中國(guó)鱟的研究(洪水根, 2011), 深入開(kāi)展了包括地理分布(翁朝紅 等, 2012; 顏明艷等, 2019)、資源現(xiàn)狀和價(jià)值(李瓊珍 等, 2011; 翁朝紅 等, 2012; 朱俊華 等, 2020)、生活習(xí)性(高鳳英 等, 2003)、人工繁育(鮑虞園 等, 2020; 梁君榮 等, 2001; 王軍 等,2001; 王德祥 等2001; 程鵬 等, 2006)等方面的研究工作。

人工增殖放流是恢復(fù)鱟資源最有效、最迅速的方法(洪水根, 2011), 中國(guó)鱟苗種規(guī)?；斯し庇膶?shí)現(xiàn)為中國(guó)鱟資源的保護(hù)和修復(fù)奠定了扎實(shí)基礎(chǔ),目前沿海多地開(kāi)展了中國(guó)鱟幼苗大規(guī)模放流活動(dòng)。然而, 幼鱟在放流海區(qū)多變環(huán)境中的生存和生長(zhǎng)狀況沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)研究, 難以保證人工放流的成效和可行性。了解和掌握環(huán)境因子對(duì)中國(guó)鱟幼鱟生長(zhǎng)狀況的影響規(guī)律, 進(jìn)而選擇適宜放流的時(shí)間和海區(qū),是保證人工放流得以成功的當(dāng)務(wù)之急。鹽度作為主要的環(huán)境因子, 可對(duì)甲殼動(dòng)物的生理產(chǎn)生廣泛影響,水體鹽度的變化直接影響其生長(zhǎng)性能、成活率和繁殖等(陳垂坤 等, 2015)。有關(guān)鹽度對(duì)中國(guó)鱟影響的研究?jī)H有零星報(bào)道, 李鋒 等(1999)研究表明中國(guó)鱟人工授精育苗的可行鹽度為16‰～40‰, 適宜鹽度為16‰～33‰; 王德祥 等(2001)研究了授精后中國(guó)鱟胚胎和三葉幼體發(fā)育的最適鹽度為20‰; 中國(guó)鱟胚后一期幼體的耗氧率和排氨率隨著鹽度的升高,呈先升后降的趨勢(shì), 均在 35‰時(shí)達(dá)到峰值(程文,2007)。鹽度對(duì)幼鱟蛻殼的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)研究不同鹽度下中國(guó)鱟幼鱟存活、蛻殼、滲透調(diào)節(jié)、免疫指標(biāo)、抗氧化能力等的變化, 探討不同鹽度水平對(duì)幼鱟生長(zhǎng)和生理的影響, 為中國(guó)鱟人工育苗和人工放流提供基礎(chǔ)資料, 同時(shí)豐富鱟生理生態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用中國(guó)鱟一齡幼鱟來(lái)源于廣西海洋研究所有限責(zé)任公司竹林海水增養(yǎng)殖基地人工繁育的同一親本所產(chǎn)的同批次苗種, 廣西海洋研究所有限責(zé)任公司為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的珍稀瀕危水生動(dòng)物(中國(guó)鱟)增殖放流苗種供應(yīng)單位。挑選活力較好的健康個(gè)體(平均體質(zhì)量30.82±0.79mg)作為試驗(yàn)對(duì)象。不同鹽度水平養(yǎng)殖試驗(yàn)在規(guī)格為29cm×20cm×15.5cm 的塑料整理箱中進(jìn)行, 試驗(yàn)用海水為砂濾自然海水,鹽度為29.7‰, 用充分曝氣的自來(lái)水和海水晶調(diào)節(jié)試驗(yàn)組海水鹽度, 水溫維持在29～32℃之間。

1.2 不同鹽度水平中國(guó)鱟幼鱟養(yǎng)殖試驗(yàn)

試驗(yàn)共設(shè)置8 個(gè)鹽度梯度, 分別為5‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰、40‰, 每個(gè)梯度設(shè)3 個(gè)平行組, 共24 個(gè)試驗(yàn)組, 每個(gè)試驗(yàn)組整理箱內(nèi)放幼鱟150 只。幼鱟在自然海水中暫養(yǎng)7d 后開(kāi)始鹽度試驗(yàn), 將其隨機(jī)分組稱(chēng)重后直接從對(duì)照組轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)組。

養(yǎng)殖日常管理: 養(yǎng)殖試驗(yàn)期間投喂鹵蟲(chóng)幼體,每天在18:00 進(jìn)行投喂, 投餌前先用吸管吸出殘餌及糞便。每?jī)商鞙y(cè)一次鹽度, 便于調(diào)節(jié)蒸發(fā)引起的鹽度變化, 每周徹底清洗塑料箱并換水, 清洗前先用濾網(wǎng)撈出幼鱟, 用百潔布徹底清理后加入自然砂濾海水, 調(diào)至所需鹽度再放入幼鱟。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)56d。

1.3 樣品收集與分析

為防止養(yǎng)殖后期有試驗(yàn)組大部分幼鱟蛻殼為二齡而取不到足夠的一齡幼鱟樣本, 養(yǎng)殖30d 時(shí), 每組隨機(jī)撈取一齡幼鱟50 只, 純水沖洗拭干后, -80℃冰箱保存用于一齡幼鱟酶活的測(cè)定, 蛻殼率、成活率僅統(tǒng)計(jì)剩余的100 只幼鱟。

從有幼鱟蛻殼開(kāi)始, 每天根據(jù)鱟殼數(shù)量統(tǒng)計(jì)蛻殼幼鱟的個(gè)數(shù)。養(yǎng)殖56d 后, 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束, 收集一齡幼鱟和二齡幼鱟, 分別稱(chēng)重后計(jì)數(shù), 統(tǒng)計(jì)成活率、蛻殼率及蛻殼增重率, 純水沖洗拭干后, 保存于-80℃冰箱, 用于酶活測(cè)定。

蛻殼增重率(molting weight gain rate)計(jì)算:

蛻殼增重率(%)= (二齡幼鱟平均體質(zhì)量 - 一齡幼鱟平均體質(zhì)量)/一齡幼鱟平均體質(zhì)量 × 100%

1.4 酶活測(cè)定

將冷凍的一齡(測(cè)試用的一齡幼鱟為養(yǎng)殖30 天保存的樣本)及二齡幼鱟轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器, 加入預(yù)冷的生理鹽水, 充分勻漿后, 勻漿液用冷凍離心機(jī)(Jouan, C3i, 法國(guó))離心10min(4 ℃, 3000r·min-1), 上清液即為待測(cè)酶液。

Na+-K+-ATP 酶、溶菌酶(lysozyme, LZM)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT) 、 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力以及總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測(cè)定。待測(cè)酶液蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn), 用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 22.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 若差異達(dá)到顯著(P＜0.05),則用Tukey 多重比較各組數(shù)據(jù)之間的差異, 結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度對(duì)幼鱟成活率、蛻殼率、體質(zhì)量和蛻殼增重率的影響

不同鹽度對(duì)中國(guó)鱟幼鱟的成活率、蛻殼率、體質(zhì)量、蛻殼增重率影響的結(jié)果見(jiàn)表1。不同鹽度對(duì)中國(guó)鱟幼鱟的成活率、蛻殼率、二齡幼鱟平均體質(zhì)量及蛻殼增重率有顯著影響(P＜0.05), 且均隨鹽度升高呈先升高后降低的趨勢(shì)。鹽度20‰試驗(yàn)組幼鱟的成活率最高達(dá)96.30%, 顯著高于鹽度5‰和10‰試驗(yàn)組(P＜0.05); 鹽度20‰、25‰、30‰和35‰試驗(yàn)組的幼鱟蛻殼率顯著高于高鹽和低鹽試驗(yàn)組(P＜0.05), 25‰試驗(yàn)組最高, 蛻殼率達(dá)92.08%; 鹽度5‰試驗(yàn)組的二齡幼鱟均重顯著小于25‰試驗(yàn)組(P＜0.05); 隨著鹽度的升高, 幼鱟蛻殼增重率先顯著升高(P＜0.05)后顯著降低(P＜0.05), 鹽度20‰和25‰試驗(yàn)組的幼鱟蛻殼增重率顯著高于鹽度5‰和40‰試驗(yàn)組(P＜0.05)。二次回歸分析(圖1)表明, 中國(guó)鱟幼鱟蛻殼率和鹽度的二次曲線回歸方程為:y=-01438x2+6.9323x+8.3767(R2=0.891), 當(dāng)蛻殼率達(dá)到最大值時(shí), 對(duì)應(yīng)的鹽度為24.10‰; 蛻殼增重率和鹽度的二次曲線回歸方程為:y=-0.0616x2+3.072x+31.339(R2=0.7998), 當(dāng)蛻殼增重率達(dá)到最大值時(shí), 對(duì)應(yīng)的鹽度為24.94‰。

表1 不同鹽度下中國(guó)鱟幼鱟成活率、蛻殼增重率和蛻殼率Tab. 1 Survival rate, molting weight gain rate and molting rate of the juvenile horseshoe crab under different salinity

2.2 不同鹽度對(duì)幼鱟Na+-K+-ATP 酶活性的影響

圖2 為不同鹽度下幼鱟Na+-K+-ATP 酶活性的變化趨勢(shì), 結(jié)果表明, 幼鱟Na+-K+-ATP 酶活性均隨鹽度的升高呈先顯著升高(P＜0.05)后顯著降低(P＜0.05)的趨勢(shì), 一齡幼鱟的酶活為鹽度25‰試驗(yàn)組最高,顯著高于35‰和40‰試驗(yàn)組(P＜0.05), 二齡幼鱟則是鹽度30‰試驗(yàn)組最高, 顯著高于鹽度5‰和40‰試驗(yàn)組(P＜0.05) 。

2.3 不同鹽度對(duì)幼鱟免疫酶活性的影響

不同鹽度對(duì)幼鱟免疫酶活性影響的結(jié)果見(jiàn)表2。鹽度對(duì)一齡幼鱟的ACP 和AKP 活性有顯著影響(P＜0.05), 對(duì)LZM 活性沒(méi)有顯著影響(P＞0.05); 高鹽度試驗(yàn)組(35‰和40‰)一齡幼鱟的ACP 活性顯著高于鹽度較低試驗(yàn)組; 鹽度 5‰試驗(yàn)組一齡幼鱟的AKP 活性顯著低于其他試驗(yàn)組(P＜0.05)。鹽度對(duì)二齡幼鱟的ACP、AKP 和LZM 活性均沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。

表2 不同鹽度對(duì)幼鱟免疫酶活性的影響Tab. 2 Effect of salinity on immune enzyme activity of the juvenile horseshoe crab

2.4 不同鹽度對(duì)幼鱟抗氧化酶活性的影響

不同鹽度對(duì)幼鱟抗氧化酶活性影響的結(jié)果見(jiàn)表3。不同鹽度對(duì)一齡幼鱟的CAT 活性有顯著影響(P＜0.05), 對(duì)T-AOC、GSH-Px 和SOD 活性沒(méi)有顯著影響(P＞0.05), 高鹽度試驗(yàn)組(35‰和40‰)一齡幼鱟的CAT 活性顯著高于鹽度較低試驗(yàn)組(P＜0.05)。鹽度對(duì)二齡幼鱟的 GSH-Px 活性有顯著影響(P＜0.05), 對(duì)T-AOC、CAT 和SOD 活性沒(méi)有顯著影響(P＞0.05), 二齡幼鱟的GSH-Px 活性隨著鹽度的升高而升高的趨勢(shì), 鹽度10‰試驗(yàn)組顯著低于30‰和40‰試驗(yàn)組(P＜0.05) 。

表3 不同鹽度對(duì)幼鱟抗氧化酶活性的影響Tab. 3 Effect of salinity on antioxidant enzyme activity of the juvenile horseshoe crab

3 討論

同其他節(jié)肢動(dòng)物一樣, 鱟的生長(zhǎng)是不連續(xù)的,通過(guò)蛻殼來(lái)實(shí)現(xiàn)。中國(guó)鱟生長(zhǎng)速度非常慢, 發(fā)育至性成熟一般需要13～15 年的時(shí)間(李瓊珍, 2010)。水溫適宜時(shí), 一齡幼鱟從孵化到蛻殼為二齡幼鱟一般需要3～5 個(gè)月, 水溫較低情況下一齡幼鱟可以保持1 年以上不蛻殼。剛蛻殼二齡鱟的甲殼非常柔軟, 要恢復(fù)至原來(lái)的硬度也需要相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間。

鹽度是水生生物生長(zhǎng)環(huán)境中最重要的環(huán)境因子之一, 許多水生動(dòng)物都具有一定程度的鹽度適應(yīng)性,且不同物種的最佳存活和生長(zhǎng)鹽度范圍不同。研究表明鹽度對(duì)不同甲殼動(dòng)物存活、蛻殼和生長(zhǎng)影響的差異較大, 且同一甲殼動(dòng)物, 不同發(fā)育階段對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍也有所不同, 如高鹽(45‰)和低鹽(≤15‰)環(huán)境遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunus pelagicus)的死亡率均顯著升高, 同時(shí)高鹽和低鹽都延長(zhǎng)了梭子蟹的蛻殼周期, 降低了蛻殼增重(Romano et al, 2006)。5‰～25‰范圍內(nèi), 斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)蛻殼間期隨鹽度升高而延長(zhǎng), 鹽度30‰以后又縮短, 鹽度25‰試驗(yàn)組對(duì)蝦的蛻殼周期最長(zhǎng), 特定生長(zhǎng)率最高(楊其彬等, 2008); 路良允 等(2012)在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的研究中發(fā)現(xiàn), 鹽度30‰組蟹的生長(zhǎng)率顯著高于15‰和35‰試驗(yàn)組, 各組間蛻殼周期差異不顯著, 但30‰組較其他組縮短3.1～4.6d; 青蟹(Scylla serrata)幼蟹在變態(tài)為四期幼蟹之前, 對(duì)環(huán)境鹽度有較高要求, 鹽度低于10‰, 將延長(zhǎng)變態(tài)周期和降低成活率, 四期以后鹽度適應(yīng)能力明顯增強(qiáng),適當(dāng)降低鹽度將有助于縮短其蛻殼周期(于忠利 等,2010)。在脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)(龍曉文 等, 2014)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)(申玉春 等, 2012)、南極大磷蝦(Euphausia superba)(趙國(guó)慶 等, 2018) 、 日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)(蔣湘 等, 2017)等甲殼動(dòng)物中也開(kāi)展了相關(guān)研究, 研究結(jié)果不盡相同, 但大致可分為兩類(lèi): (1)不適鹽度刺激甲殼動(dòng)物加快蛻殼, 蛻殼間期縮短,但生長(zhǎng)率并沒(méi)有因此而增加; (2)不適鹽度阻礙甲殼動(dòng)物的蛻殼過(guò)程, 蛻殼間期延長(zhǎng), 生長(zhǎng)率也隨之下降。環(huán)境鹽度變化時(shí), 動(dòng)物機(jī)體必然要經(jīng)歷滲透調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程, 這些過(guò)程需消耗大量能量, 因而鹽度變化增加了機(jī)體的能量消耗(Martínez-álvare et al, 2002)。本研究中, 在5‰～40‰的鹽度范圍內(nèi), 中國(guó)鱟幼鱟的成活率、蛻殼增重率及蛻殼率均隨鹽度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì), 即高鹽和低鹽等不適環(huán)境引起幼鱟蛻殼率降低、生長(zhǎng)率下降, 屬于第(2)類(lèi)情況, 與遠(yuǎn)海梭子蟹的研究結(jié)果類(lèi)似。自然條件下幼鱟通常在離繁殖沙灘很近的潮間帶平坦沙灘度過(guò)一齡和二齡, 一般棲息在淺水區(qū)蛻皮, 蛻殼率和蛻殼增重率與鹽度的回歸分析均表明, 中國(guó)鱟幼鱟蛻殼與生長(zhǎng)的最適鹽度在24‰～25‰左右。

甲殼類(lèi)Na+-K+-ATP 酶活性與水體環(huán)境鹽度密切相關(guān), 鹽度主要通過(guò)滲透壓調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生理狀態(tài)的影響, 而Na+-K+-ATP 酶在滲透壓調(diào)節(jié)中起著極其重要的作用(柳旭東 等, 2009)。有研究表明, 水生動(dòng)物自身滲透壓調(diào)節(jié)基本過(guò)程為: 隨著水體環(huán)境鹽度的改變, Na+-K+-ATP 酶活性逐漸升高或逐漸降低, 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的調(diào)節(jié)與適應(yīng)后逐步趨于穩(wěn)定, 不同物種Na+-K+-ATP 酶活變化趨勢(shì)和變化程度截然不同, 存在很大的種間差異(楊宇晴 等, 2010;亓磊 等, 2013; 蔡星媛 等, 2015; 李娜 等, 2017;游出超 等, 2019)。且當(dāng)鹽度范圍超出機(jī)體的滲透調(diào)節(jié)能力, 機(jī)體將表現(xiàn)為酶活性降低, 抵抗力低下,嚴(yán)重者將導(dǎo)致死亡。本研究鹽度范圍內(nèi), 隨著鹽度升高, 一齡和二齡幼鱟的Na+-K+-ATP 酶活性均呈先顯著升高后顯著降低趨勢(shì)。因養(yǎng)殖試驗(yàn)周期較長(zhǎng),測(cè)定的酶活應(yīng)為穩(wěn)定期活性, 說(shuō)明高鹽和低鹽導(dǎo)致了中國(guó)鱟幼鱟Na+-K+-ATP 酶活性降低, 即環(huán)境鹽度變化超過(guò)幼鱟的滲透調(diào)節(jié)能力, 這是高鹽組(40‰)和低鹽組(5‰)幼鱟死亡率顯著升高的一個(gè)重要原因。

一般認(rèn)為無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏特異性免疫性系統(tǒng),而是以各種非特異性免疫因子及酶類(lèi)為主的體液免疫抵抗病原的入侵, 甲殼動(dòng)物亦是如此。外界鹽度過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)引起機(jī)體內(nèi)外滲透壓失衡, 進(jìn)而導(dǎo)致甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)速度和非特異免疫能力下降(李志輝 等, 2019)。ACP 和AKP 在甲殼動(dòng)物的免疫應(yīng)答機(jī)制中, 直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移與代謝, 可加速物質(zhì)的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn), 形成水解酶體系, 破壞和消除侵入機(jī)體的異物(吳丹華 等, 2010)。本研究中, 不同鹽度試驗(yàn)組一齡幼鱟的ACP 和AKP 活性有顯著差異, 35‰和40‰高鹽度試驗(yàn)組一齡幼鱟的ACP 活性顯著高于鹽度較低試驗(yàn)組, 而鹽度5‰試驗(yàn)組一齡幼鱟的AKP 活性顯著低于其他試驗(yàn)組, 結(jié)果一定程度上反應(yīng)了幼鱟在高鹽和低鹽脅迫環(huán)境下的不適應(yīng), 磷酸酶活性降低可能導(dǎo)致機(jī)體對(duì)物質(zhì)的吸收和代謝降低, 最終表現(xiàn)為蛻殼率和蛻殼增重率下降。與免疫指標(biāo)類(lèi)似, 幼鱟體內(nèi)的一些抗氧化指標(biāo)同樣也能反映出其對(duì)不同鹽度的適應(yīng)程度, SOD、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶對(duì)清除氧化脅迫過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧自由基起著決定性作用, 當(dāng)機(jī)體自由基平衡被破壞時(shí), 抗氧化酶活性會(huì)相應(yīng)變化來(lái)維持機(jī)體內(nèi)的氧化平衡。本研究中35‰和40‰高鹽度試驗(yàn)組一齡幼鱟的CAT 活性顯著高于鹽度較低試驗(yàn)組, 鹽度10‰試驗(yàn)組二齡幼鱟的GSH-Px 活性顯著低于30‰和40‰試驗(yàn)組, 這說(shuō)明幼鱟在高鹽環(huán)境下的滲透調(diào)節(jié)過(guò)程消耗更多的能量來(lái)保持機(jī)體滲透壓平衡, 新陳代謝較快, 產(chǎn)生的活性氧自由基較多, 因而抗氧化酶活性更高。

4 結(jié)論

鹽度對(duì)中國(guó)鱟幼鱟生長(zhǎng)、蛻殼、Na+-K+-ATP 酶活性、免疫指標(biāo)和抗氧化能力有顯著影響, 幼鱟蛻殼生長(zhǎng)最適宜的鹽度在24‰～25‰之間, 鹽度過(guò)高或過(guò)低都將引起幼鱟滲透調(diào)節(jié)能力、免疫力和抗氧化力顯著降低, 最終表現(xiàn)為生長(zhǎng)率和成活率下降。