李亞男, 陸霖青, 張鵬, 秦真東, 林蠡, 晏磊

1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院, 廣東省水環(huán)境與水產(chǎn)品安全工程技術(shù)研究中心, 廣州市水產(chǎn)病害與水禽養(yǎng)殖重點實驗室,廣東 廣州 510225;

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣東 廣州 510300

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)原產(chǎn)于東南亞淡水和咸淡水水域, 現(xiàn)今已在巴西、孟加拉國、厄瓜多爾、馬來西亞、印度等許多國家都有養(yǎng)殖(De Almeida Marques et al, 2012)。我國最早于1976 年從日本引進(jìn)羅氏沼蝦, 1977 年實現(xiàn)繁育成功。由于羅氏沼蝦養(yǎng)殖周期短、生長速度快、適應(yīng)性強, 深受養(yǎng)殖戶喜愛, 目前已在江蘇、福建、上海、廣東、廣西等20 多個省進(jìn)行推廣養(yǎng)殖(肖楚康 等, 2019),是我國重要的經(jīng)濟蝦類之一(Miao et al, 2020)。然而,隨著羅氏沼蝦高密度養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展, 由病毒和細(xì)菌引起的各種疾病給該養(yǎng)殖行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失 (Khuntia et al, 2008; Lin et al, 2010; 董學(xué)洪等, 2015)。據(jù)報道, 嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是危害羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一(Onming et al, 2018)。因此, 進(jìn)一步了解羅氏沼蝦的免疫機制對于指導(dǎo)其疾病防控至關(guān)重要。

羅氏沼蝦屬于無脊椎動物, 主要依靠先天免疫系統(tǒng)來抵御病原入侵, 包括免疫識別、體液免疫、免疫穩(wěn)態(tài)維持和信號傳導(dǎo)幾個方面(Li et al, 2013a,b)。當(dāng)病原入侵機體時, 宿主可產(chǎn)生大量具有殺菌作用的活性氧分子(reactive oxygen species, ROS), 如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子自由基(O2-)、羥基自由基(OH-)等(Bogdan et al, 2000), 但是過多的ROS積累會對機體造成氧化應(yīng)激, 進(jìn)而損害生物大分子,破壞機體內(nèi)穩(wěn)態(tài), 加快疾病病程(Li et al, 2020)。生物體通過抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài), 因此,抗氧化系統(tǒng)也被認(rèn)為是先天性免疫非常重要的組成部分(Li et al, 2018; 李亞男 等, 2018)?？寡趸到y(tǒng)主要由抗氧化酶系統(tǒng)以及一些非酶類小分子組成,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽、維生素E 等(Li et al,2018)。其中, SOD 因其對O2-的快速特異性解毒效應(yīng)而備受關(guān)注(Noor et al, 2002; Muth et al, 2004; Li et al, 2019)。依據(jù)其金屬配體的不同, SOD 又分為CuZnSOD、MnSOD 和FeSOD 三種主要類型(Li et al,2019)。其中, MnSOD 主要定位于胞質(zhì)和線粒體中。

有研究表明, 線粒體呼吸鏈?zhǔn)钱a(chǎn)生ROS 的主要場所之一(Mazat et al, 2020), 因此線粒體MnSOD(mMnSOD)被認(rèn)為是機體抵御氧化應(yīng)激的第一道防線, 作用至關(guān)重要。但是目前關(guān)于甲殼動物mMnSOD 的研究還處于初級階段, 除了認(rèn)識到mMnSOD 可通過調(diào)節(jié)機體氧化還原穩(wěn)態(tài)參與非特異免疫外, 對該蛋白其他免疫功能的認(rèn)識還非常有限。雖已有學(xué)者從羅氏沼蝦中成功克隆了mMnSOD基因(MrmMnSOD), 但并未對蛋白功能開展深入研究(Cheng et al, 2006)。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn), 魁蚶(Scapharca broughtonii)MnSOD 具有一定的抑菌功能(Zheng et al, 2015)。因此, 本研究克隆了MrmMnSOD, 制備了多克隆抗體, 首次分析了嗜水氣單胞菌刺激下, 該基因在不同組織中的表達(dá)模式,并對該蛋白的抑菌功能進(jìn)行初步探究, 研究結(jié)果不僅豐富了甲殼動物先天性免疫基礎(chǔ)理論, 也將為羅氏沼蝦養(yǎng)殖與病害防控提供依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實驗材料與采樣

實驗所用羅氏沼蝦購自廣州市金洋水產(chǎn)公司,體長10±2cm, 暫養(yǎng)于28℃充氣循環(huán)水中適應(yīng)一周后開始實驗。實驗所用嗜水氣單胞菌于37℃無抗LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)活化, 使用無菌PBS 清洗菌體三次后, 使用無菌 PBS 重懸菌液濃度至 1×106CFU·mL-1(Srisapoome et al, 2018)。將暫養(yǎng)的羅氏沼蝦隨機分為實驗組和對照組, 每尾蝦分別腹肌注射100 mL 1×106CFU·mL-1嗜水氣單胞菌或等量無菌PBS, 注射后0、3、6、12 和24h, 采集肝胰腺和腸組織進(jìn)行總RNA 提取和基因表達(dá)模式分析。每個時間點取3 只蝦進(jìn)行混樣, 平均取3 次。

1.2 總RNA 提取與基因克隆

使用Trizol 法提取總RNA, 使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性, 使用超微量分光光度計NP80(德國, IMPLEN)檢測 RNA 的純度。根據(jù)GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit(北京擎科生物有限公司)操作說明, 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。根據(jù)GenBank 中羅氏沼蝦 mMnSOD 開放閱讀框序列(ABU55004.1), 設(shè)計 PET-32a 載體一步克隆引物MrmMnSOD-32a S 和MrmMnSOD-32a A(表1), 以cDNA 為擴增模板, 擴增羅氏沼蝦MrmMnSOD 基因序列。

表1 引物序列Tab. 1 Primers used in the study

1.3 重組蛋白表達(dá)與純化

參照 ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)使用說明,將一步克隆引物擴增得到的羅氏沼蝦mMnSOD 基因序列與相應(yīng)雙酶切(EcoRⅠ和 Xhol)線性化的PET-32a 載體進(jìn)行同源重組反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞, 進(jìn)行陽性克隆子篩選。陽性克隆子測序檢驗正確后, 提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)表達(dá)菌株進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。使用0.5mmol·L-1IPTG 在180r·min-1、37℃下震蕩培養(yǎng)5～6h, 以7000r·min-1離心5min, 收集菌體, 使用PBS 清洗菌體三次并重懸, 低溫下超聲波破碎菌體,12% SDS-PAGE 膠檢測融合蛋白的表達(dá)情況。之后,根據(jù)福因德生物《蛋白表達(dá)與抗體制備》技術(shù)手冊對包涵體進(jìn)行純化與復(fù)性回收。首先使用PBS 在4℃下, 8000r·min-1, 10min 洗滌菌體4～5 次。然后分別 用20mL buffer A(50mmol·L-1Tris-HCI,25mmol·L-1EDTA-2Na, pH=8.0) 、 20mL buffer B(50mmol·L-1Tris-HCI, 5mmol·L-1EDTA-2Na、2mol·L-1脲, pH 為8.0)溶解雜質(zhì), 于4℃, 8000r·min-1下離心 10min, 去上清。最后使用 10mL buffer c(0.1mol·L-1Tris-HCI, 10mmol·L-1MDTT, 8mol·L-1脲, pH 為8.0)溶解蛋白質(zhì), 4℃ 10000r·min-1離心10min 保留上清, 去沉淀。將前述上清裝入透析袋中,置于 50 倍體積透析液(0.1mol·L-1Tris-HCl,5mmol·L-1EDTA-2Na, 5mmol·L-1Cysteins, pH 為8.0)中, 4℃下透析16h 以上, 之后再使用PBS 于4℃下透析16h 以上, 最終得到純化復(fù)性后的重組蛋白。

1.4 抗體制備與檢測

用上海碧云天公司Bradford 蛋白濃度測定試劑盒測定純化回收的重組蛋白濃度, 達(dá)到送樣要求后送至武漢福因德公司免疫新西蘭大白兔, 制備兔源性MrmMnSOD 多克隆抗體血清?？贵w制備完成后,采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)檢測抗體效價,具體操作如下: 用50mmol·L-1的碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)溶解抗原, 使抗原濃度為10～20μg·mL-1, 每孔加100μL 到96 孔酶標(biāo)板, 4℃過夜。第二天棄去包被液后, 用PBST 洗滌3 次, 每孔加入150μL 1%BSA 37℃封閉1h。PBST 洗滌后, 每孔加入不同濃度的血清和對照樣品, 37℃孵育2h。然后洗去血清一抗加入HRP 標(biāo)記的二抗, 37℃孵育1h。最后清洗二抗加入顯色劑顯色20min 后, 酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。

1.5 mRNA 水平表達(dá)模式分析

cDNA 經(jīng) 4 倍稀釋后, 根據(jù) quantinova-SYBR-Green PCR 試劑盒, 制備20μL 反應(yīng)體系檢測MrmMnSOD 在嗜水氣單胞菌刺激下的基因表達(dá)模式: 2×SYBR Green PCR Master Mix QN 10μL,RNase-free water 7μL, cDNA 模板 2μL, 引物(MrmMnSOD S1/ MrmMnSOD A1)各0.5μL。使用ABI 7500 Real Time PCR 儀(ABI, 美國)進(jìn)行基因定量分析, 反應(yīng)條件如下: 95℃ 2min; 95℃ 5s; 60℃30s; 72℃ 40s, 40 個循環(huán)。內(nèi)參基因選擇18S rRNA,引物見表1。采用2-ΔΔCt方法計算基因mRNA 水平相對表達(dá)量。

1.6 蛋白水平表達(dá)模式分析

為探索MrmMnSOD 在蛋白水平的表達(dá)變化,注射嗜水氣單胞菌對羅氏沼蝦進(jìn)行免疫刺激后, 分別取攻毒后12h 和24h 肝胰腺、腸組織保存于4%的多聚甲醛中, 送至武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行組織石蠟包埋切片制作。之后, 石蠟切片經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、血清封閉30min, 加一抗4℃過夜孵育, 加二抗室溫避光孵育50min 后, 進(jìn)行DAPI細(xì)胞核復(fù)染和抗熒光淬滅封片劑封片, 最后, 將切片至于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和圖像采集。

1.7 蛋白抑菌試驗

為初步探究重組MrmMnSOD 的免疫學(xué)功能,選用三種革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(Escherichia coli) 、 嗜水氣單胞菌、 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和兩種革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)檢測重組蛋白的抑菌功能。方法參照Zheng 等(2015)進(jìn)行, 略做修改。實驗開始前, 菌株在適宜條件下進(jìn)行過夜活化, 使用無菌PBS 清洗菌體三次后, 重懸菌液調(diào)整濃度至2×107CFU·mL-1。將菌液與蛋白樣品按照1:1 加入96 孔酶標(biāo)板中培養(yǎng), 蛋白終濃度分別為50μg·mL-1和100μg·mL-1, 每組設(shè)置3 個重復(fù), PBS作為空白對照。37℃下孵育12h, 每小時用酶標(biāo)儀讀取A630 值。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用 SPSS 21.0 軟件中單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 分析差異性。所有數(shù)據(jù)均以平均值(n=3)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。P＜ 0.05 和P＜0.01 分別被認(rèn)為有顯著差異和極顯著差異。作圖使用Graphpad prism7.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)模式分析

為了初步探討MrmMnSOD 是否參與抗菌免疫反應(yīng), 使用嗜水氣單胞菌感染羅氏沼蝦后, 采集了肝胰腺和腸組織, 對MrmMnSOD 基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1 所示, 肝胰腺中, MnSOD 的基因表達(dá)量在感染3h 后迅速升高至0h 的7.7 倍, 之后快速下降; 腸組織中MnSOD 的基因表達(dá)量在感染6h 后達(dá)到峰值, 為0h 表達(dá)量的4.5 倍, 之后表達(dá)量下降, 并在感染24h 后又升高至0h 的3.8 倍。該結(jié)果表明, mMnSOD 顯著響應(yīng)羅氏沼蝦對嗜水氣單胞菌感染的免疫應(yīng)答。

2.2 重組蛋白表達(dá)檢測

如圖2 所示, 經(jīng)0.5mmol·L-1IPTG 37℃誘導(dǎo)5～6h后, 重組蛋白可在大腸桿菌中 BL21 中大量表達(dá)。MrmMnSOD 蛋白由218 個氨基酸組成, 推測分子量約為24kDa, PET-32a 載體標(biāo)簽蛋白約為18kDa, 因此推測表達(dá)的重組蛋白大小約為40kDa, 與預(yù)期分子量大小一致。純化后的重組蛋白純度可達(dá)90%以上, 滿足后續(xù)抗體制備要求。

2.3 多克隆抗體效價檢測

如圖3 所示, ELISA 效價檢測結(jié)果顯示, 制備的MrmMnSOD 多克隆抗體效價可達(dá)1250000 倍。

2.4 蛋白水平表達(dá)模式分析

采用組織免疫熒光法分析嗜水氣單胞菌感染期間羅氏沼蝦肝胰腺和腸中MrmMnSOD 蛋白水平表達(dá)模式。結(jié)果表明, 嗜水氣單胞菌感染可顯著激活免疫組織中MrmMnSOD 的表達(dá)水平(圖4、5)。具體地, 肝胰腺和腸中MrmMnSOD 的表達(dá)變化呈現(xiàn)相似的趨勢, 隨著感染時間的延長, 熒光強度不斷增加, 12h 時熒光強度達(dá)到最大, 感染后24h 熒光強度有所降低。

2.5 蛋白抑菌活性

羅氏沼蝦mMnSOD 蛋白與細(xì)菌的共培養(yǎng)實驗結(jié)果如圖6 所示, 實驗所選的5 種細(xì)菌在與重組蛋白共培養(yǎng)12h 內(nèi), 都呈現(xiàn)相似的生長趨勢, 生長明顯受到抑制。與PBS 對照組相比, 100 和50μg·mL-1兩個蛋白濃度都能顯著抑制菌體生長, 但抑制效果與蛋白濃度的依賴關(guān)系并不顯著。僅實驗后期,如副溶血弧菌培養(yǎng)至 8～12h, 無乳鏈球菌培養(yǎng)至5～10h 時, 100μg·mL-1重組蛋白的抑菌效果呈現(xiàn)略微高于50μg·mL-1濃度的抑菌活性?？傮w而言, 以上結(jié)果表明, 在本實驗濃度下, 羅氏沼蝦mMnSOD重組蛋白可顯著抑制常見革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長。

3 討論

羅氏沼蝦是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類之一,病害的頻繁爆發(fā)已經(jīng)成為阻礙該產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一, 因此對其開展免疫機制的研究十分必要。羅氏沼蝦屬無脊椎動物, 主要依靠先天免疫來防御病原體入侵, 通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量ROS 殺滅入侵病原, 然而過量的ROS 如果得不到及時清除,就會破壞機體氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài), 從而加速疾病進(jìn)程(Li et al, 2020, 2021)。線粒體是產(chǎn)生ROS 的主要場所之一(Mazat et al, 2020), 因此, mMnSOD 被認(rèn)為是機體對抗氧化應(yīng)激的第一道防線, 受到研究者的廣泛關(guān)注(Wang et al, 2018)。

研究表明, 哺乳動物的mMnSOD 活性喪失與各種疾病發(fā)生有關(guān), 例如帕金森病、癌癥等(Noor et al, 2002; Tao et al, 2012)。水生生物中, mMnSOD 的研究相對滯后, 目前已從海馬 (Hippocampus abdominalis)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)等物種中克隆得到了mMnSOD 基因 (Umasuthan et al, 2012; Zhao et al,2014; Perera et al, 2017)。日本囊對蝦、中國對蝦、南美白對蝦、羅氏沼蝦、小龍蝦等蝦類的mMnSOD基因也相繼被報道(Cheng et al, 2006; Zhang et al,2007; Lin et al, 2010; Gu et al, 2014; González-Ruiz et al, 2021)。結(jié)果均顯示, 病原刺激能夠顯著激活上述物種中mMnSOD 的表達(dá)水平, 表明mMnSOD 與水生生物的抗菌免疫反應(yīng)有關(guān)。然而上述研究僅涉及基因表達(dá)層面, 未涉及蛋白表達(dá)水平以及該蛋白具體的免疫功能研究。嗜水氣單胞菌是水生環(huán)境中常見的細(xì)菌性條件致病菌, 可感染羅氏沼蝦各個生活史階段, 引起高的死亡率(Sung et al, 2000;Onming et al, 2018), 但目前還未見羅氏沼蝦mMnSOD 在嗜水氣單胞菌感染中作用的相關(guān)報道。

本研究對MrmMnSOD 在嗜水氣單胞菌感染中的作用機制進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明, 嗜水氣單胞菌感染后, 羅氏沼蝦免疫組織中的mMnSOD 無論是從基因表達(dá)水平, 還是蛋白表達(dá)水平, 都受到了明顯誘導(dǎo), 證實該蛋白能夠積極參與嗜水氣單胞菌所引起的免疫應(yīng)答反應(yīng), 這與中國對蝦、南美白對蝦等物種中mMnSOD 的研究結(jié)果相一致(Zhang et al, 2007; González-Ruiz et al, 2021)。然而對于該蛋白更為深入的免疫功能, 目前了解還非常有限。近年來發(fā)現(xiàn), 魁蚶的MnSOD 具有一定的抗菌功能, 可顯著抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌(Micrococcus leteus)的生長 (Zheng et al,2015), 那么MrmMnSOD 是否具有類似的功能？為此, 我們進(jìn)行了羅氏沼蝦重組mMnSOD 抑菌功能實驗, 結(jié)果表明, 該重組蛋白能夠有效抑制三種革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌)和兩種革蘭氏陽性細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌)的生長, 且在檢測濃度范圍內(nèi), 該抑制作用與蛋白濃度的依賴關(guān)系并不顯著。當(dāng)前研究結(jié)果與魁蚶MnSOD 類似, 證實MrmMnSOD 可能屬于免疫相關(guān)分子, 通過發(fā)揮抑菌功能而參與免疫反應(yīng)。抑菌功能的強弱可能與細(xì)菌種類及表面結(jié)構(gòu)相關(guān)(Zheng et al, 2015)。前人研究發(fā)現(xiàn), 內(nèi)毒素受體CD14 含有一個LPS 結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 可與細(xì)菌或LPS結(jié)合, 長牡蠣(Crassostrea gigas)SOD 就具有這樣一個結(jié)構(gòu)域, 這可能是SOD 具有抗菌活性原因之一(Gonzalez et al, 2005)。另外, 推測菌體生長代謝過程中, 會向培養(yǎng)基中釋放一定的超氧陰離子自由基,超氧陰離子自由基極不穩(wěn)定, 可被添加到培養(yǎng)基中的SOD 轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的過氧化氫, 而環(huán)境中過氧化氫酶相對不足, 從而造成過氧化氫積累, 產(chǎn)生殺菌作用, 但以上推測均有待進(jìn)一步實驗證實。