耿天天,葉 成,雷振宇,申 邦,,方 瑞,胡 敏,,趙俊龍,,周艷琴,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北武漢 430070；2.湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，湖北武漢 430070)

雞球蟲病是一種或者多種艾美耳球蟲共感染于禽類腸道的禽病，當(dāng)前控制雞球蟲病主要是通過在飼料里添加抗球蟲藥[1]，隨之而來的雞球蟲耐藥性問題始終困擾著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[2]。河南省和湖北省是禽類養(yǎng)殖大省，其中河南省2018年禽蛋產(chǎn)量為413.61萬噸，湖北省為171.53萬噸，2016年河南省家禽出欄量為93 420萬只，湖北省為52 105.9萬只。面對規(guī)模如此之大的養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)，保證產(chǎn)蛋率和出肉率的穩(wěn)定是一項巨大工程，因此把好雞球蟲病的防控關(guān)，其重要性不言而喻。地克珠利作為一種目前較為常用的抗球蟲藥[3]，監(jiān)測其在該地區(qū)的耐藥現(xiàn)狀具有重要的現(xiàn)實意義。本研究中，河南11個地區(qū)和湖北11個地區(qū)的雞球蟲地方分離株作為研究對象，以最適抗球蟲活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)、病變積分減少率(reduction of lesion scores，RLS)、相對卵囊產(chǎn)量(relative oocyst production，ROP)和抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)4項指標(biāo)綜合評價[4]各蟲株對地克珠利的耐藥性，以對該地區(qū)的用藥提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 所用的動物均為白羽肉雞，雛雞于1日齡購自湖北省荊州市正康飼料有限公司，后轉(zhuǎn)飼于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)野芷湖雞房。

1.1.2 蟲株 所用的蟲株保存于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實驗室，具體蟲種見表1和表2。

1.1.3 藥物和主要試劑 所用的地克珠利，由上海獸醫(yī)研究所提供。重鉻酸鉀(分析純)，天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 HITACHI高速冷凍離心機，日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 球蟲蟲種的擴繁 將每株球蟲分離株分別作為一組，每組5只雞進行口服感染孢子化卵囊，收集感染后7 d和8 d的糞便，采用飽和食鹽水漂浮法進行分離保種，而后于28.6 ℃培養(yǎng)箱進行孢子化培養(yǎng)，待其80%完成孢子化后將蟲株保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雞體籠養(yǎng)試驗分組 將1日齡的白羽肉雞飼養(yǎng)至13日齡，稱重后淘汰體重過輕或者過重的雞，而后對每只雞進行編號分組，耐藥性試驗共分為3組：感染用藥組，感染不用藥組以及不感染不用藥組(即為空白對照組)，并于13日齡開始于感染用藥組給藥0.2 g/kg，14日齡稱重作為初始體重，并于當(dāng)日進行攻蟲，攻蟲劑量為每只雞0.5×104個卵囊，21日齡稱重作為終末體重，并收集感染后6 d～7 d的糞便，進行卵囊計數(shù)；在21日齡將雞只處死取雞腸道，觀察并記錄腸道病變計分。

1.2.3 耐藥性評價 以最適抗球蟲活性(POAA)、病變積分減少率(RLS)、相對卵囊產(chǎn)量(ROP)以及抗球蟲指數(shù)(ACI)對地克珠利進行耐藥性評價，在4項指標(biāo)中，1項指標(biāo)為陽性，則表明其為輕度耐藥，2項指標(biāo)為陽性時，則表明其為中度耐藥，3項和4項指標(biāo)為陽性時，則表明其為高度耐藥。

最適抗球蟲活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)% =(感染用藥組增重-感染不用藥組增重/不感染不用藥組增重-感染不用藥組增重)×100%

最適抗球蟲活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)≥50%為敏感，<50%為耐藥。

病變積分減少率(reduction of lesion scores，RLS)=(感染不給藥組的平均病變值-感染給藥組的平均病變值)/感染不給藥組的平均病變值 ×100%

病變積分減少率(reduction of lesion scores，RLS)≥ 50%為敏感，<50%為耐藥。

相對卵囊產(chǎn)量(relative oocyst production，ROP)= 感染給藥組卵囊總數(shù)/感染不給藥組卵囊總數(shù)×100%

相對卵囊產(chǎn)量(relative oocyst production，ROP)<15%為敏感，≥15%為耐藥。

抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)=(相對增重率+存活率)-(病變分值+卵囊值)

相對增重率(%)=感染用藥組的品均增重/不感染不用藥的平均增重×100%

存活率(%)=試驗結(jié)束時雞只數(shù)/試驗開始時雞只數(shù)×100%

卵囊值，按角田清[5]克糞便卵囊數(shù)(oocysts per gramme，OPG)值的方法進行

病變分值 = 平均盲腸病變積分(0～4)×10

卵囊比數(shù)(%)=不感染對照組或感染用藥組卵囊數(shù)/感染不給藥組卵囊數(shù)×100%

抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)≥160，判為陰性；抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)≤160，判為陽性[6]。

2 結(jié)果

通過以上4項指標(biāo)對每一株分離蟲株的綜合評價，從表1和表2的結(jié)果可以看出，在河南省34株分離蟲株中，有1株對地克珠利輕度耐藥，4株對地克珠利中度耐藥，29株高度耐藥；湖北省35株分離蟲株中，有1株中度耐藥，34株高度耐藥。

表1 河南省雞球蟲分離株對地克珠利耐藥性判別結(jié)果

表2 湖北省雞球蟲分離株對地克珠利耐藥性判別結(jié)果

3 討論

耐藥性在雞球蟲中廣泛存在，這目前是制約養(yǎng)禽業(yè)快速發(fā)展的最大難題之一。在幾種常見的抗雞球蟲藥中，地克珠利近些年來的普及使得對其耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，因此對于地克珠利耐藥機制的研究逐漸提上了日程。有研究顯示，地克珠利可以在很低的藥物濃度下，使雞球蟲體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張并空泡化[7]，而且對宿主本身不產(chǎn)生任何影響，除此之外還可抑制球蟲磷酸合成中心PSⅡ的重要組成成分D1蛋白質(zhì)的功能。而D1蛋白質(zhì)與低氧狀態(tài)的電子傳遞有關(guān)系，有可能提供蟲體氧自由基，使其更容易侵入宿主細(xì)胞[8]。但是目前監(jiān)測一個地區(qū)抗球蟲藥的耐藥性仍舊依賴傳統(tǒng)的雞體籠養(yǎng)試驗，雞體籠養(yǎng)試驗?zāi)壳澳軌蜃畲蟪潭鹊姆从吵鲈摰貐^(qū)試驗用藥的耐藥現(xiàn)狀。本研究中，發(fā)現(xiàn)河南省和湖北省兩省雞球蟲分離株對地克珠利耐藥現(xiàn)象十分普遍，僅有1株蟲株為輕度耐藥，共計5株蟲株中等程度耐藥，其余蟲株全部高度耐藥，這反映出兩省地克珠利的防控雞球蟲壓力較大。該研究結(jié)果對于該地區(qū)雞球蟲病的防治提出了更高的要求，需要針對該地雞球蟲的情況制定相應(yīng)的防治方法，穿梭用藥和聯(lián)合用藥是最易實施的方法，另外適當(dāng)?shù)妮啌Q用藥對防治也有幫助，但不論是穿梭用藥、聯(lián)合用藥或是輪換用藥都應(yīng)當(dāng)嘗試一些新藥或者本地區(qū)不常用的抗球蟲藥。有一些新型雞球蟲藥的問世比如新型三嗪類藥物[9]往往在一段時間內(nèi)能實現(xiàn)對雞球蟲的有效防控，另外混合傳統(tǒng)中草藥[10]的相關(guān)研究對于雞球蟲防控方式提出了新的思路，但不論是中藥還是新型藥物長時間施用后難免產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。當(dāng)然，除了用藥，傳統(tǒng)的疫苗防控法確為有效，隨著對雞球蟲的抗原方面的進一步研究，頂膜抗原(apical membrane antigen，AMA)-1[11]和免疫定位蛋白(immunolocalization protein，IMP)-1已引入重組疫苗作為對抗雞球蟲病的替代控制措施。目前正在探索通過穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲作為艾美耳球蟲疫苗抗原的新型遞送載體，該方法使得多種疫苗抗原同時刺激機體進而提高了保護功效，以轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲作為載體的方法可以填補作為抗球蟲疫苗，用于雞球蟲病控制的空白[12]。此外，能夠?qū)⒁呙缃臃N法和聯(lián)合穿梭用藥并行的方法對雞球蟲病進行防控也是近些年來的防控新策略，不過該方法對于養(yǎng)雞場的用藥監(jiān)控和成本條件的要求較高，未來還有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>