蘇夢茹，葉 超，趙學亮，馮 航，王 娟，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊陵 712100

大腸埃希菌(Escherichiacoli)俗稱大腸桿菌，是一種兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌。其根據(jù)致病力特性主要分為3個亞群，即非致病性的共生菌、腸內(nèi)致病性大腸埃希氏菌(Intestinal pathogenicEscherichiacoli,IPEC)和腸外致病性大腸埃希氏菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,Ex PEC)[1]。研究指出，Ex PEC是一類能引起人和動物腸外組織感染的重要人畜共患病病原體，不僅可以定植在腸道，還能引起局部腸道外的感染如腦膜炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、關節(jié)炎、敗血癥等疾病[2]。近年來經(jīng)濟動物養(yǎng)殖過程中的Ex PEC的發(fā)病率、病死率均有上升的趨勢，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失[3]。2021年6月，陜西省某豬場仔豬發(fā)生肺炎，主要表現(xiàn)精神倦怠、咳嗽和呼吸不暢等癥狀，臨床上仔豬體格消瘦、生長發(fā)育不良，給養(yǎng)殖場帶來經(jīng)濟損失。本研究對送檢的患病仔豬進行剖檢，進行病原菌的分離和鑒定，確定為腸外致病性大腸埃希氏菌，并對其耐藥性進行分析，為臨床病原診斷治療提供基礎資料和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 陜西省某豬場精神不佳、生長緩慢、體格消瘦并伴有肺炎等臨床癥狀的仔豬，剖檢后肺臟充血水腫、暗紅，無菌采集仔豬病變肺部組織低溫送至實驗室。

1.1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、CAMHB培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR StarMix，北京Genstar生物科技有限公司產(chǎn)品；細菌微量生化反應管，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；抗菌藥物，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；

1.1.3 實驗動物 體格均勻的昆明小鼠，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.4 儀器設備 細菌培養(yǎng)96孔板，廣州潔特生物過濾股份有限公司產(chǎn)品；電子天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)文獻[4-7]設計通用引物擴增16S rRNA基因、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetC、TEM、SHV、OXA、CTX等10種耐藥基因引物(表1)，送至西安擎科澤西生物技術有限責任公司合成。

表1 耐藥基因PCR引物

1.2.2 細菌分離鑒定 將無菌采集的豬肺組織接種到血平板上，將平板放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取血平板上典型的單個灰白色大菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細菌形態(tài)。若為純培養(yǎng)物，將其接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.3 生化試驗 將分離到的細菌純化培養(yǎng)，選取葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、尿素、鳥氨酸脫羧酶、甘露醇、山梨醇、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素、甲基紅、VP和吲哚等生化反應管，無菌接種針挑取純化后的菌落接種于細菌微量生化反應管，將其放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 16S rRNA序列PCR鑒定 刮取LB平板上的菌落至生理鹽水中，煮沸法提取細菌DNA，對其16S rRNA序列進行PCR鑒定，PCR反應條件為20 μL體系：10 μL 2×Mix預混液，上、下游引物各1 μL，模版DNA 1 μL，雙蒸水補至20 μL。反應程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。預期擴增片段為1 600 bp，PCR陽性產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物技術有限責任公司測序，測序結(jié)果上傳NCBI網(wǎng)站進行序列比對，確定菌種。

1.2.5 藥敏試驗 根據(jù)CLSI文件[8]所述藥敏試驗標準，利用微量肉湯稀釋法測定菌株對選用抗菌藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，細菌用96孔板每孔加入50 μL CAMHB培養(yǎng)基，并將氨芐西林、復方阿莫西林、慶大霉素、四環(huán)素、替加環(huán)素、頭孢噻呋鈉、頭孢他定、恩諾沙星、氟苯尼考、美羅培南、多黏菌素B和磺胺異惡唑等12種抗菌藥物進行濃度梯度稀釋。在LB瓊脂平板上刮取大腸埃希氏菌菌落，生理鹽水稀釋為麥氏濁度為0.5的菌液。質(zhì)控菌為大腸埃希氏菌25922，每60 μL菌液與5 mL藥敏接種培養(yǎng)液混合均勻后，按照每孔50 μL加入96孔細菌培養(yǎng)板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。通過觀察96孔細菌培養(yǎng)板內(nèi)大腸埃希氏菌生長情況，統(tǒng)計試驗菌株對所選抗菌藥物的最小抑菌濃度，并根據(jù)CLSI文件判斷試驗菌株對所選抗菌藥物敏感性。

1.2.6 小鼠致病性試驗 將大腸埃希氏菌分離株接種于血平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用生理鹽水沖洗收集菌液，調(diào)節(jié)菌液濃度為1×108CFU/mL。選取體格健康狀態(tài)均勻的昆明小鼠10只，隨機分為試驗組和對照組，每組5只，試驗組小鼠腹腔接種大腸埃希氏菌液0.3 mL/只，對照小組注射等量的生理鹽水。室溫下分籠飼養(yǎng)，每日觀察小鼠的健康狀況。小鼠死亡后立即剖檢，觀察各臟器病變，無菌摘取小鼠肺臟，切面涂抹在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細菌形態(tài)。

1.2.7 耐藥基因檢測 參照表1所述引物的文獻方法，對大腸埃希氏菌分離株進行tetA、tetB、tetC、sul1、sul2、sul3、sul、TEM、SHV、OXA、CTX等10種耐藥基因進行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離鑒定結(jié)果

2.1.1 細菌染色鏡檢結(jié)果 病變的肺臟組織劃線接種到血平板37 ℃培養(yǎng)24 h后有形態(tài)單一的菌落生長，表現(xiàn)為濕潤、圓形隆起的灰白色菌落，直徑約1 mm左右，不溶血；在麥康凱上呈現(xiàn)紅色、表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落，革蘭氏染色鏡檢可見分離株為革蘭氏陰性、散在或成對兩端鈍圓的短桿菌(圖1)。

A.血平板；B.麥康凱培養(yǎng)基；C.顯微鏡鏡檢觀察(1 000×)

2.1.2 生化特性 分離菌株的生化特性結(jié)果見表2，其生化試驗結(jié)果符合大腸埃希氏菌的生化特性。

表2 分離菌株的生化特性

2.1.3 16S rRNA基因測序與分析 16S rRNA序列經(jīng)PCR鑒定擴增出預期大小的目的條帶(圖2)，PCR產(chǎn)物送至生物公司測序，測序結(jié)果利用NCBI的Blast在線功能，比對發(fā)現(xiàn)分離株與NCBI登錄號MN208080.1的菌株具有98%的同源性。

M.DNA 標準DL 2 000;16S rRNA；+.陽性對照;-.陰性對照

2.2 細菌最小抑菌濃度結(jié)果

根據(jù)CLSI文件利用微量肉湯稀釋法測定藥物MIC值，根據(jù)表3藥敏結(jié)果顯示，大腸埃希氏菌分離株對氨芐西林、復方阿莫西林、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢噻呋鈉、頭孢他啶、恩諾沙星和氟苯尼考、磺胺異惡唑等9種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥，對替加環(huán)素、美羅培南以及多黏菌素B等3種抗菌藥物顯示敏感。

表3 分離株的最小抑菌濃度

2.3 小鼠致病性試驗

腹腔接種大腸埃希氏菌分離株培養(yǎng)物12 h后，試驗組小鼠出現(xiàn)明顯的精神沉郁、食欲減退、被毛蓬亂和呼吸急促等癥狀，24 h～36 h后試驗組全部小鼠死亡，對照組小鼠精神狀態(tài)良好。無菌剖檢死亡小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠的腸道、肝臟和肺臟有不同程度的出血，腸道呈暗紫色、松軟狀態(tài)(圖3A)；肺臟紅腫、出血(圖3B)。將肺臟用無菌剪刀裁剪剖面接種到伊紅美藍培養(yǎng)基后，回收到帶有金屬光澤的紫黑色菌落(圖4)，染色鏡檢為革蘭氏陰性的短桿菌，PCR鑒定為大腸埃希氏菌。

A.小鼠腸道病變;B.肺臟病變

圖4 伊紅美藍培養(yǎng)基上肺臟切面培養(yǎng)的大腸埃希氏菌

2.4 耐藥基因鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定，分離到的大腸埃希氏菌攜帶sul3、tetA和TEM3種耐藥基因(圖5)，未檢測到其他7種耐藥基因。

M.DNA 標準DL 2 000;1.sul1；2.sul2；3.sul3；4.tetA；5.tetB；

3 討論

豬大腸桿菌病是由于感染某些致病性大腸埃希氏菌而發(fā)生的一種急性傳染病，主要臨床癥狀是腸毒癥、腸炎等，多見于仔豬，發(fā)病后會嚴重損害養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益，尤其是腸外致病性大腸埃希氏菌的潛在危害性[9-10]。臨床上由Ex PEC引發(fā)的腦膜炎、腹膜炎、肺炎、敗血癥等疾病常不能及時的確診和治療，往往給養(yǎng)殖業(yè)帶來不少損失。本研究對送檢有肺炎癥狀的仔豬進行剖檢和病原的分離鑒定，在病變的肺臟中分離到大腸埃希氏菌，且經(jīng)小鼠致病性試驗也驗證了該菌可引起肺部炎癥，判定該大腸埃希氏菌分離株為腸外致病性大腸埃希氏菌。

為了臨床上更合理的用藥，利用微量肉湯稀釋法對該大腸埃希氏菌分離株進行了藥敏試驗，藥敏結(jié)果顯示，該大腸埃希氏菌分菌株對臨床常用的幾種抗菌藥物都有不同程度的耐藥。其中對氨芐西林(β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物)、復方阿莫西林(青霉素類)、慶大霉素(氨基糖胺類)、四環(huán)素(四環(huán)素類)、頭孢噻呋鈉和頭孢他啶(頭孢菌素類)、恩諾沙星(喹諾酮類)、氟苯尼考(氯霉素類)、磺胺異惡唑(磺胺類)等9種藥物均表現(xiàn)耐藥，對替加環(huán)素、美羅培南以及多黏菌素B顯示敏感。試驗分離到的豬源大腸埃希氏菌其耐藥特性與丁建華等[11]研究的豬源大腸埃希氏菌的耐藥性相似，對阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素等抗菌藥物表現(xiàn)多重耐藥。據(jù)報道，臨床上豬源Ex PEC的耐藥狀況已經(jīng)不容樂觀。張璇等[12]發(fā)現(xiàn)分離到的134株豬源Ex PEC的耐藥譜高達59種，98%的菌株為多重耐藥菌株，耐受10種抗菌藥物的菌株高達92%，其中氨芐西林、阿莫西林、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和磺胺異惡唑等藥物的耐藥率都在85%以上。不僅如此除了青霉素類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺和磺胺類等藥物耐藥嚴重外，由于抗菌藥物的不合理使用，人們發(fā)現(xiàn)臨床上大腸埃希氏菌對于頭孢類等抗菌藥物耐藥性也呈增加的趨勢[13-15]。目前Ex PEC的臨床分離情況和耐藥范圍愈加嚴重，本研究結(jié)果可為養(yǎng)殖過程中發(fā)生的腸外致病性大腸桿菌病的診斷和治療提供參考。