喻洪江，孔慶波*，方少華

(1.重慶警察學(xué)院，重慶 401331；2.浙江東方基因生物制品股份有限公司，浙江安吉 313300)

目前，研制一種靈敏度和準(zhǔn)確性高、簡(jiǎn)便快捷的毒品濫用檢測(cè)方法，一直是毒品濫用防控領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)問題之一。檢測(cè)濫用麻醉品主要有兩個(gè)目的，即甄別和確證，而不同的目的，往往選擇不同的檢測(cè)方法。甄別，也稱初步檢測(cè)，常被用于大批量分析多個(gè)樣品，主要是根據(jù)所選擇的某種麻醉品的臨界濃度，提供初步的定性分析結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果預(yù)示了該種麻醉品的存在與否。這種檢測(cè)方法和器具一般要具備設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、使用便捷、靈敏性高以及檢測(cè)場(chǎng)所條件要求不高等特點(diǎn)。確證，即準(zhǔn)確證明某種麻醉品的存在，是對(duì)指定麻醉品更專門的分析。確證檢測(cè)方法的化學(xué)原理一般不同于甄別方法，可以選擇的方法有氣液層析法(GLC)、高效液相色譜法(HPLC)以及氣相色譜/質(zhì)譜分析法(GC/MS)等[1]。但困擾毒品現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)領(lǐng)域的國(guó)際性難題和關(guān)鍵技術(shù)是檢測(cè)時(shí)間窗口期偏短、檢測(cè)準(zhǔn)確性不高、血液和尿液等檢材采集不夠便捷等問題。有鑒于此，依據(jù)對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性、時(shí)效性、便捷性和樣本儲(chǔ)存的需求，將熒光標(biāo)記技術(shù)和傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合，建立一種采用毛發(fā)作為檢測(cè)嗎啡樣本的時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)，有望實(shí)現(xiàn)毒品分析的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。

1 嗎啡毛發(fā)熒光免疫檢測(cè)試劑盒

1.1 最低檢測(cè)濃度

由浙江東方基因生物制品股份有限公司研制的嗎啡毛發(fā)檢測(cè)試劑盒(熒光免疫層析法，生產(chǎn)許可證編號(hào)：浙食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20120108號(hào))，采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及熒光免疫層析技術(shù)，通過抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合毒品偶聯(lián)劑和毛發(fā)中可能含有的毒品的原理，結(jié)合配套儀器的使用可以定性和定量的檢測(cè)毛發(fā)樣本中是否含有嗎啡待測(cè)物，根據(jù)公安部2018年發(fā)布的《涉毒人員毛發(fā)樣本檢測(cè)規(guī)范》規(guī)定的陽(yáng)性檢測(cè)臨界濃度標(biāo)準(zhǔn)，毛發(fā)中嗎啡的最低檢測(cè)濃度定為0.2 ng/mg。

1.2 檢測(cè)原理

熒光免疫層析技術(shù)以固定有檢測(cè)線(包被抗原)和質(zhì)控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，以測(cè)試液為流動(dòng)相，熒光標(biāo)記抗體固定于連接墊，通過毛細(xì)管作用使待分析物在層析條上移動(dòng)。檢測(cè)時(shí)，毛發(fā)標(biāo)本在毛細(xì)效應(yīng)下向上層析會(huì)出現(xiàn)兩種顯示結(jié)果：如是陰性，毛發(fā)樣本與熒光抗體不結(jié)合，熒光抗體與特定毒品偶聯(lián)劑結(jié)合，配套儀器檢測(cè)結(jié)果為陰性；如是陽(yáng)性，則毛發(fā)樣本的毒品與熒光抗體先發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)毛發(fā)樣本中的毒品含量達(dá)到一定量時(shí)，熒光抗體就不再與測(cè)試區(qū)的特定毒品偶聯(lián)劑結(jié)合，配套儀器檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

1.3 定量檢測(cè)反應(yīng)體系及試劑主要成分

1.3.1 定量檢測(cè)反應(yīng)體系 反應(yīng)體系如圖1所示。嗎啡毛發(fā)檢測(cè)試劑盒，采用高度特異性的抗體與毒品偶聯(lián)劑反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，試劑盒含有被事先固定于膜上測(cè)試區(qū)(T)的特定毒品偶聯(lián)劑和結(jié)合墊(聚酯膜)上的熒光標(biāo)記抗體。當(dāng)將樣品滴加在加樣區(qū)時(shí)，樣品中的待測(cè)物與結(jié)合墊中的熒光微球標(biāo)記抗體結(jié)合并通過毛細(xì)作用向前層析，當(dāng)達(dá)到檢測(cè)區(qū)后，剩余的熒光微球標(biāo)記抗體與檢測(cè)線上的抗原結(jié)合。因此，檢測(cè)線(T線)上結(jié)合的熒光微球標(biāo)記抗體與樣品中待測(cè)物的量成反比，質(zhì)控線(C線)結(jié)合的熒光標(biāo)記物與樣品中待測(cè)物的量無關(guān)，其他熒光標(biāo)記物繼續(xù)層析達(dá)到吸收區(qū)。層析結(jié)束后，采用熒光讀數(shù)儀的讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度并計(jì)算T/C值，通過ID卡(用于識(shí)別和存儲(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)曲線)內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣品中待測(cè)物的基本含量，再通過儀器內(nèi)置的陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)來判斷待測(cè)樣品的陰陽(yáng)性。

圖1 試劑盒反應(yīng)體系示意圖

1.3.2 試劑主要成分 主要組成包括包被用嗎啡抗原、標(biāo)記用嗎啡抗體、羊抗兔多克隆抗體、兔IgG、硝酸纖維素膜、聚酯纖維膜等。

2 配套的檢測(cè)儀器

2.1 毛發(fā)毒品痕量快速分析儀

根據(jù)時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)原理，如浙江東方基因生物制品股份有限公司與重慶警察學(xué)院聯(lián)合研制生產(chǎn)了配套儀器——毛發(fā)毒品痕量快速分析儀，型號(hào)規(guī)格為OG-G200。

2.2 配套檢測(cè)儀器工作原理

以熒光標(biāo)記特異性抗體作為熒光指示劑的新型熒光免疫層析技術(shù)。分析儀內(nèi)置激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm的LED光源，熒光微球受激發(fā)后發(fā)射610 nm的熒光，通過光電轉(zhuǎn)換器將檢測(cè)線和質(zhì)控線上的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，然后通過每批次ID卡上的標(biāo)準(zhǔn)曲線信息自動(dòng)計(jì)算濃度，判斷陰、陽(yáng)性，并呈現(xiàn)在儀器的顯示屏上。

3 毛發(fā)樣本的采集及檢測(cè)

依據(jù)公安部《涉毒人員毛發(fā)樣本檢測(cè)規(guī)范》提取毛發(fā)樣本時(shí)，工作人員應(yīng)當(dāng)佩戴一次性手套，使用醫(yī)用剪刀或者鋸齒剪刀緊貼被提取人員頭皮表面剪取頭頂后部(如頭頂后部無法提取到足夠頭發(fā)的，可選擇離該部位最近的頭部部位)長(zhǎng)度為3 cm以內(nèi)的頭發(fā)；長(zhǎng)于3 cm的頭發(fā)，需從發(fā)根端截取3 cm，提取的毛發(fā)樣本應(yīng)當(dāng)分為A、B兩份，每份樣本重量不少于50 mg，用鋁箔紙包裹，分別裝入紙質(zhì)信封后將信封封裝。

3.1 毛發(fā)樣本的處理

3.1.1 稱量 稱取10 mg樣本毛發(fā)(約3 cm的毛發(fā)20根)。

3.1.2 研磨 用鑷子將毛發(fā)放入研磨管中，使用專用研磨儀研磨2 min。

3.2 配套儀器檢測(cè)

3.2.1 準(zhǔn)備 打開配套熒光免疫分析儀。

3.2.2 讀取ID卡 確認(rèn)ID卡與試劑的批號(hào)是否匹配，無誤后插入ID卡，在進(jìn)入測(cè)試界面點(diǎn)擊讀ID卡，讀取完成，即可檢測(cè)毛發(fā)樣本試劑。

3.2.3 選擇 在儀器界面上的樣本類型中選擇“毛發(fā)”。

3.2.4 裂解 將毛發(fā)裂解液加入已研磨好毛發(fā)的研磨管中，蓋緊瓶蓋，振蕩混勻裂解1 min。

3.2.5 加樣 用滴管吸取毛發(fā)裂解液的上清液，滴加3滴在試劑板的加樣孔中。

3.2.6 讀數(shù) 試劑卡(嗎啡毛發(fā)檢測(cè)試劑盒)加樣后機(jī)外反應(yīng)3 min，反應(yīng)結(jié)束后立即將試劑卡插入儀器中，點(diǎn)擊“測(cè)試”按鈕，系統(tǒng)將自動(dòng)讀卡并給出測(cè)試結(jié)果，超過5 min后讀取的結(jié)果為無效。

3.3 檢測(cè)結(jié)果的解釋

3.3.1 陽(yáng)性(+) 界面出現(xiàn)結(jié)果顯示為陽(yáng)性，陽(yáng)性結(jié)果表明毛發(fā)中藥物濃度在0.2 ng/mg以上。

3.3.2 陰性(-) 界面出現(xiàn)結(jié)果顯示為陰性，陰性結(jié)果表明毛發(fā)中藥物濃度在0.2 ng/mg以下。

3.3.3 無效 當(dāng)檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)“C線異?！保砻鞑徽_的操作過程、試劑已變質(zhì)損壞或者線位不匹配。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試劑重新測(cè)試。如果問題仍然存在，應(yīng)立即停止使用此批號(hào)產(chǎn)品，并與當(dāng)?shù)毓?yīng)商聯(lián)系。

3.4 檢測(cè)注意事項(xiàng)

3.4.1 毛發(fā)樣品采集 貼緊頭皮剪取，將采集的頭發(fā)平放于清潔紙袋或自封袋中。

3.4.2 器械消毒 用鑷子夾取頭發(fā)前，需用酒精棉片擦拭干凈，避免交叉污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.4.3 勿重復(fù)使用 本試劑盒(測(cè)試卡)為一次性使用體外診斷試劑，請(qǐng)勿重復(fù)使用。

3.4.4 注意自身防護(hù) 在收集、處置、儲(chǔ)存、混勻樣本和檢測(cè)過程中應(yīng)采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施。

3.4.5 試劑盒要完整 試劑盒(測(cè)試卡)在使用前請(qǐng)不要開封，不要使用有明顯損壞的試劑盒、包裝有破損的測(cè)試卡。

3.4.6 試劑和ID卡使用要匹配 不同批號(hào)的試劑不能混用，ID卡與試劑盒(測(cè)試卡)不得混批號(hào)使用。

3.4.7 使用配套儀器 試劑盒(測(cè)試卡)及其組件僅適用于配套的毒品痕量快速分析儀。

3.4.8 注意損壞儀器或污染 切勿把表面被其他液體沾濕的試劑盒(測(cè)試卡)插入檢測(cè)儀，否則會(huì)污染或損壞儀器；用過的試劑盒(測(cè)試卡)請(qǐng)妥善處理，不要隨意丟棄。

3.4.9 溫度要求 應(yīng)避免實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度過高，低溫保存的試劑盒(測(cè)試卡)需要恢復(fù)至室溫后再打開，以免吸潮。

3.4.10 規(guī)范儀器操作 試劑盒(測(cè)試卡)和配套毒品痕量快速分析儀在使用時(shí)應(yīng)避開顫動(dòng)和電磁環(huán)境：在正常使用中儀器本身顫動(dòng)屬正?，F(xiàn)象；檢測(cè)進(jìn)行時(shí)請(qǐng)勿拔出ID卡。

3.4.11 檢測(cè)時(shí)間要求 為保證準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，試劑盒(測(cè)試卡)的機(jī)外反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在3 min，超過5 min后讀取的結(jié)果無效。

3.5 樣本檢測(cè)

根據(jù)“國(guó)家安全防范報(bào)警系統(tǒng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(上海)”和“公安部安全防范報(bào)警系統(tǒng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心”共同認(rèn)定并發(fā)布的檢驗(yàn)檢測(cè)報(bào)告(報(bào)告編號(hào)：公滬檢202143306)：通過嗎啡檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)，嗎啡毛發(fā)檢測(cè)試劑盒(熒光免疫層析法，生產(chǎn)許可證編號(hào)：浙食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20120108號(hào))配合專用的毛發(fā)毒品痕量快速分析儀(型號(hào)規(guī)格為OG-G200)，在檢出率不小于90%的前提下，在進(jìn)樣量為80 μL時(shí)，對(duì)濃度為2 ng/mL(2 ng/mL相當(dāng)于0.2 ng/mg)的嗎啡毛發(fā)樣品進(jìn)行采樣分析，檢測(cè)限應(yīng)≤0.16 ng/mg。

4 免疫熒光技術(shù)優(yōu)勢(shì)與局限性

4.1 目前常用嗎啡檢測(cè)技術(shù)

嗎啡(morphine)為阿片受體激動(dòng)劑，分子式為C17H19NO3，分子質(zhì)量為285.3 u，它具有強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，對(duì)一切疼痛均有效，同時(shí)具有較強(qiáng)的藥物成癮性，一般連續(xù)使用1至2周即可出現(xiàn)耐受性，濫用劑量是普通治療量的20至200倍[2]。其分子結(jié)構(gòu)式見圖2所示。

圖2 嗎啡分子結(jié)構(gòu)式示意圖

目前，檢測(cè)嗎啡的技術(shù)主要有：①實(shí)驗(yàn)室理化檢測(cè)法，如化學(xué)反應(yīng)、物理識(shí)別等。此類方法優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)速度快；缺點(diǎn)是與免疫法比較靈敏度差、精確度差、步驟較復(fù)雜等②免疫法，如ELISA、膠體金、熒光、化學(xué)發(fā)光等。此類方法具有反應(yīng)速度快、靈敏度高、成本低、方便攜帶等優(yōu)點(diǎn)，是目前國(guó)際通用的篩查方法。③色譜法，如氣相層析法、氣相色譜/質(zhì)譜分析法(GC/MS)、液相色譜/質(zhì)譜分析法(LC/MS)等。此類方法優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高；缺點(diǎn)是成本高、操作復(fù)雜、需要專門儀器等。④光譜法，如原子光譜、分子光譜(拉曼光譜)等。

4.2 熒光免疫技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

免疫層析技術(shù)(immunochromatographic assay，ICA)是20世紀(jì)末發(fā)展起來的結(jié)合免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)的一種分析方法，該方法具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等重要領(lǐng)域[3]。這種傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)是以膠體金為標(biāo)記物，通過條帶顯色對(duì)目標(biāo)物定性檢測(cè)或半定量分析，方法雖然簡(jiǎn)單快速，但靈敏度較差，難以準(zhǔn)確定量。而熒光免疫層析技術(shù)作為一種新型免疫檢測(cè)技術(shù)，既保留了傳統(tǒng)膠體金試紙條的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)，又加入了熒光檢測(cè)技術(shù)的高靈敏度特點(diǎn)，成為提高免疫層析方法檢測(cè)性能的主要途徑之一[4]。熒光免疫層析法的建立，是基于時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)，而時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)是基于熒光標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合發(fā)展創(chuàng)新的一種抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度[5]。其原理是：對(duì)于只具有單一抗原表位的待測(cè)小分子抗原(如違禁藥物、農(nóng)藥、獸藥等)與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合后，由于空間位阻作用難以再與檢測(cè)線上的包被抗原結(jié)合，是一種競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析法。此種方法大多用來檢測(cè)具有單一抗原表位的小分子待測(cè)物，見表1所示。

表1 主要查毒方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

熒光與抗體標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)使用的標(biāo)記方法是化學(xué)偶聯(lián)，即抗體上的氨基(-NH3)和熒光上的羧基(-COOH)脫水縮合[6]。這種標(biāo)記方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①標(biāo)記過程反應(yīng)溫和，標(biāo)記后的抗體高活性、高結(jié)合率；②無需復(fù)雜的設(shè)備進(jìn)行純化；③重復(fù)性可控，批間差小；④標(biāo)記后抗體穩(wěn)定，可大批量標(biāo)記生產(chǎn)、保存。

4.3 熒光免疫技術(shù)的局限性

熒光與抗體標(biāo)記技術(shù)只能用于初篩檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果目前不作為確認(rèn)藥物濫用的依據(jù)，下一步將與氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)等確證分析方法做對(duì)比研究試驗(yàn)，以確認(rèn)其使用靈敏度和特異性的水平。

另外，易造成假陰性或假陽(yáng)性。造成假陰性結(jié)果的原因主要有：服用嗎啡藥物時(shí)間尚短，藥物還未代謝至毛發(fā)中，導(dǎo)致結(jié)果未檢出[7-8]；毛發(fā)研磨不充分或者反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)或過短等操作不正確因素；運(yùn)輸及儲(chǔ)存不當(dāng)使試劑或裂解液失效等。造成假陽(yáng)性結(jié)果的原因主要有：服用某些常用藥物或食用某些食物所致等(例如服用可待因類藥物時(shí)會(huì)導(dǎo)致嗎啡檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果)。另外，配套儀器參數(shù)的設(shè)置問題，也是影響試劑檢測(cè)結(jié)果的主要因素。

5 方法的創(chuàng)新及應(yīng)用

5.1 時(shí)間分辨熒光標(biāo)記技術(shù)

鑭系元素?zé)晒鈽?biāo)記技術(shù)時(shí)，當(dāng)鑭系元素?zé)晒獗患ぐl(fā)后，在固定時(shí)間段檢測(cè)特異性熒光，而在此時(shí)間之前，非特異性熒光已完全衰減為0。理論上1 ms為1個(gè)周期，1 s可重復(fù)測(cè)量1 000次，后取平均值，使值更準(zhǔn)確。

5.2 高效毛發(fā)裂解液

使用獨(dú)創(chuàng)的裂解毛發(fā)生物品的復(fù)合配方試劑，將毛發(fā)剪成1 cm～2 mm小段(或者采用研磨形式)，直接加入裂解液，反應(yīng)1 min，以提高毒品毛發(fā)樣本的裂解效率。

5.3 穩(wěn)定的緩沖體系

為了消除、降低個(gè)體樣本之間的基質(zhì)、pH差異，需對(duì)緩沖液的pH、離子強(qiáng)度和功能性物質(zhì)(表面活性劑、大分子物質(zhì)、惰性蛋白和小分子保護(hù)物質(zhì))的添加進(jìn)行系統(tǒng)研究，最終確定產(chǎn)品的緩沖體系。

嗎啡毛發(fā)檢測(cè)試劑盒(熒光免疫層析法)配合專用的檢測(cè)分析儀器用于阿片類藥物的初篩檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便快捷、檢測(cè)要求條件低、結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確、樣本不易摻假以及便于保存等優(yōu)點(diǎn)，可有效解決毒品查緝、毒駕管控、社區(qū)戒毒人員管控、交管系統(tǒng)各類駕駛員吸毒篩查、專業(yè)機(jī)構(gòu)吸毒篩查，以及征兵、特種行業(yè)招工吸毒篩查等過程中遇到的關(guān)鍵性技術(shù)難題，具有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景。