曹兆立，徐正中，陳 祥，焦新安

(揚州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室//揚州大學(xué)江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子(動物源)控制重點實驗室，江蘇揚州225009)

牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)又稱運輸熱(Shipping fever)，是肉牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見也是造成經(jīng)濟損失最大的疾病之一，每年造成超過10億美元的損失[1-2]。作為一種復(fù)雜的多因素疾病，BRDC危害嚴(yán)重，肉牛發(fā)病率可達75%，病死率可達50%，是引起美國養(yǎng)牛場肉牛死亡的主要原因[3]。盡管新超聲檢查技術(shù)的出現(xiàn)或許可以降低BRDC診斷難度，但總體而言，該病診斷較為困難，常常導(dǎo)致病牛無法被及時隔離和治療[4]。12.8%的牛接受了針對BRDC治療[5]，每頭牛治療費用高達數(shù)百美元[6]，可仍有0.8%的牛死于BRDC，并且治療還引發(fā)耐藥性擴散、藥物殘留等問題[7]。疫苗效果同樣不佳，有學(xué)者評價牛嗜血桿菌(Hemophilusbovis)、溶血曼海姆氏菌(Mannheimiahaemolytica)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamuliocida)疫苗接種肉牛后的效果，發(fā)現(xiàn)作用甚微[8]。即使到了采取現(xiàn)代化的飼養(yǎng)方式和預(yù)防控制措施的今天，BRDC的臨床影響仍在繼續(xù)。

BRDC的發(fā)病機制較為復(fù)雜，包括環(huán)境應(yīng)激如集約化養(yǎng)殖、極端天氣、長途運輸、斷奶、閹割與斷角等，病原體如溶血性曼氏弧菌(Vibriomansonihaemolyticus)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)昏睡嗜血桿菌(Histophilussomni)、化膿隱秘桿菌(Arcanobateriumpyogenes)等細菌，牛皰疹病毒(Bovine herpes virus 1,BHV1)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza type 3 virus,BPI3V)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea viruses,BVDV)、牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)等病毒，以及牛支原體(Mycoplasmabovis)等支原體，以及一些其他因素，包括年齡與體重、性別、抗菌藥使用和品種等。簡而言之，多種易感因素，如環(huán)境應(yīng)激、動物自身狀態(tài)、抗菌藥物使用等影響了宿主對于BRDC的易感性[9-10]，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生(圖1)。作為家畜的第一道防線，呼吸道黏膜啟動了多種天然和獲得性免疫機制從而防止細菌黏附[11]，但病原體的感染可干擾這一過程。牛呼吸道合胞體病毒感染可導(dǎo)致上皮細胞壞死，使得黏膜清除率降低，呼吸道積聚的液體增多，為細菌定植提供了適宜環(huán)境[12]；牛冠狀病毒通過上調(diào)牛呼吸道上皮細胞受體的表達來增強細菌黏附。應(yīng)激原會增加血液皮質(zhì)醇濃度，進而削弱宿主防御，減少了對上呼吸道中病原體的控制[13]。

健康狀態(tài)下，呼吸道微生物區(qū)系保持動態(tài)平衡，黏膜屏障功能完好。當(dāng)動物受多種易感因素影響，呼吸道黏膜屏障功能喪失，導(dǎo)致了病原體的黏附、定植，微生物區(qū)系失調(diào)，進入疾病狀態(tài)

黏膜微生物區(qū)系對于黏膜健康有著重要意義，但研究對象主要集中在消化道與生殖道黏膜。自2011年通過深度測序發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)存在細菌以來，呼吸道微生物區(qū)系的重要性便被逐漸發(fā)現(xiàn)[14]。新近的研究肯定了呼吸道黏膜微生物區(qū)系對牛的呼吸道健康的重要性，發(fā)現(xiàn)正常的黏膜微生物群可下調(diào)毒力因子的產(chǎn)生，對宿主起到一定保護作用[15]，并且認為處于相對平衡狀態(tài)的黏膜微生物區(qū)系可降低BRDC的發(fā)病率。本文對牛呼吸道微生物區(qū)系的研究現(xiàn)狀及其在BRDC中的作用進行綜述，為呼吸道感染和BRDC的防治提供一定的見解。目前對于病毒、噬菌體和真菌對呼吸道微生物區(qū)系的影響知之甚少，因此本文討論主要限于細菌。

1 呼吸道微生物區(qū)系的發(fā)育及影響因素

傳統(tǒng)觀念認為羊水中不存在微生物，但隨著檢測技術(shù)的進步，研究發(fā)現(xiàn)羊水中存在細菌DNA[16]，這意味著微生物區(qū)系在妊娠期便可逐步建立。人類的健康新生兒出生后的幾個小時內(nèi)便可在其上呼吸道中檢測到微生物[17]。對豬而言，胎兒分娩后的微生物區(qū)系和母體相似，主要取決于分娩途徑[18-19]。牛呼吸道微生物區(qū)系的形成同樣發(fā)生于出生不久后，其變化受到多種內(nèi)在、外在因素的影響，包括飲食、遺傳、年齡等[20]。

斷奶與其他環(huán)境應(yīng)激因素的組合對犢牛呼吸道微生物組成影響最大，這與在實際生產(chǎn)中犢牛突然斷奶并被運送至飼養(yǎng)場相對應(yīng)。送至飼養(yǎng)場頭2天內(nèi)，犢牛鼻咽部微生物區(qū)系發(fā)生了顯著變化。在系統(tǒng)發(fā)育多樣性和豐富度方面都有所增加，在運送到飼養(yǎng)場之前的第0天，所有牛鼻咽部菌群共有76個運算分類單位(operational taxonomic unit,OUT)，在第2天則達到292個OTU[21]；另一個學(xué)者也得出了相似的結(jié)論，在屬水平上，各時間點之間(斷奶、到場、到場40 d后)的犢牛鼻咽部微生物區(qū)系特征發(fā)生了明顯的變化，非參數(shù)多元方差分析表明時間是變異的重要來源[22]。呼吸道黏膜層含有抗菌肽、糖蛋白和IgA，在調(diào)節(jié)微生物區(qū)系平衡方面起著重要作用。當(dāng)犢牛處于應(yīng)激狀態(tài)，黏膜分泌去甲腎上腺素和腎上腺素，與病原體相互作用并影響它們的生長和毒力相關(guān)因子的表達[23]。犢牛來到新環(huán)境易受呼吸道病毒感染，病毒感染后在呼吸道上皮細胞中復(fù)制，引起黏膜炎癥，通過上調(diào)黏附受體、剝離上皮等方式促進病原菌的黏附和復(fù)制，還可以延長細菌脫落的持續(xù)時間[24]，從而間接改變了微生物區(qū)系。

在生產(chǎn)周期中BRDC的易感期，采取對應(yīng)的管理措施或許可通過改變犢牛鼻咽部微生物區(qū)系多樣性，從而對呼吸道健康產(chǎn)生有利影響。在斷奶早期，飲食改變可引起的腸道微生物區(qū)系的變化，對呼吸道微生物區(qū)系可能同樣有影響。給斷奶犢牛飼喂含硒苜蓿干草，犢牛鼻腔微生物區(qū)系更為豐富，擬桿菌目與梭菌目細菌數(shù)量增加[25]。益生菌可以調(diào)節(jié)微生物群落，常被用于治療腸胃疾病，這一過程在犢牛上呼吸道中同樣可以實現(xiàn)，可為BRDC的治療提供了一種新的策略[26]。牛腸道微生物區(qū)系影響呼吸微生物區(qū)系的機制還沒有完全闡明，但在其他物種中已有了較為詳細的研究[27]。

抗菌藥物的使用是預(yù)防和治療呼吸道疾病的常用手段，使用克拉霉素和甲硝唑治療患者，根據(jù)Bray-Curtis分析，患者的喉嚨和糞便菌群與治療前的組合物有很大差異，放線菌水平極低，并且一些影響可持續(xù)到4年后[28]。在兒童中，抗菌藥物的使用降低了上呼吸道有益微生物區(qū)系的相對豐度，并增加了感染的發(fā)生率[29]。給飼養(yǎng)場的牛單次注射土霉素或圖拉霉素，60 d后鼻咽部微生物區(qū)系OUT數(shù)量和香農(nóng)指數(shù)減少[30]。犢牛鼻腔滴注一氧化氮釋放液與靜脈注射替米考星，第10天時其鼻咽微生物區(qū)系的組成發(fā)生了明顯的變化[31]。

2 呼吸道微生物區(qū)系的組成

早在20世紀(jì)，就有學(xué)者通過分離培養(yǎng)的方法確認了部分與牛呼吸道疾病相關(guān)的細菌[32]。這些細菌主要從下呼吸道中分離，在健康牛與患病牛中均有發(fā)現(xiàn)，因此被認為是一種條件性致病菌。雖然高通量測序技術(shù)已有了長足發(fā)展，但時至今日，只有為數(shù)不多的研究報道了關(guān)于牛呼吸道微生物區(qū)系的組成。研究發(fā)現(xiàn)健康牛氣管微生物區(qū)系以牛支原體、溶血曼海姆氏菌和多殺性巴氏桿菌為主，鼻咽部則主要由棒狀桿菌屬、Jeotgalicoccus、嗜冷桿菌屬、游動球菌屬組成[33]。Holman D B等[34]從門的角度觀察，發(fā)現(xiàn)變形菌門與厚壁菌門占主導(dǎo)地位，放線菌門、擬桿菌門、軟壁菌門所占比例較低。牛鼻咽微生物區(qū)系在門水平上與人類嬰兒和豬的微生物區(qū)系相似[35-36]。就分類數(shù)量而言，牛鼻咽微生物區(qū)系非常的多樣化，迄今已確定近500個獨特的屬，但區(qū)系易受單一屬的支配，且大多數(shù)屬的相對豐度較低(P<0.01%)。牛鼻咽部微生物區(qū)系在個體間表現(xiàn)出很大的變異性，且多數(shù)試驗中試驗對象數(shù)量較少，因此很難去描述何為“正常的微生物區(qū)系”。

多數(shù)對呼吸道黏膜微生物區(qū)系的研究將目光聚焦于上呼吸道，因為“健康的肺部無菌”這一觀念廣為流傳，并且在一些教科書中出現(xiàn)[37]。但高通量測序技術(shù)的發(fā)展否定了這一觀念，研究表明健康的下呼吸道包含復(fù)雜且多樣化的微生物群落[26,38-39]。對在健康的飼養(yǎng)牛進行檢測，發(fā)現(xiàn)上呼吸道中的細菌群落與下呼吸道中不同，這表明在不同生物地理位置存在不同的微生物群落[40]。相比于上呼吸道微生物區(qū)系，下呼吸道微生物區(qū)系占主導(dǎo)地位的細菌主要為巴氏桿菌屬、擬桿菌屬、曼海姆氏菌屬與脲解支原體屬，這與健康人類下呼吸道微生物區(qū)系類似[41]。成人口咽部是肺部微生物區(qū)系的主要來源，而新生兒肺部微生物區(qū)系的來源更可能是上呼吸道和口咽部[22]。

3 微生物區(qū)系在呼吸道健康中的作用

呼吸道微生物區(qū)系的組成、多樣性和穩(wěn)定性既可增加牛患BRDC的機率，也可保護牛免受呼吸道細菌病原體的侵襲與定植。

致病菌的存在顯然會增加BRDC發(fā)生的機率。引起B(yǎng)RDC的主要微生物類群包括昏睡嗜血桿菌、溶血曼海姆氏菌、多殺性巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、牛支原體、牛鼻支原體(Mycoplasmabovirhinis)等[42]，這些條件性致病菌在健康和患病的牛身上都很常見[43]，在特定情況下于上呼吸道中增殖并侵入肺部。但這些細菌并非在所有牛身上都存在，普通牛群中溶血曼海姆氏菌的攜帶率可能在13%～20%之間，而在急性和致命性肺炎病例中，這一概率可高達85%～100%[44]。此外，與陰性的牛相比，到達飼養(yǎng)場時溶血曼海姆氏菌陽性的牛更有可能感染支氣管肺炎[46]。這些數(shù)據(jù)表明，限制條件性致病菌的定植將減少牛呼吸道疾病的發(fā)生[47-48]。因此，目前減輕呼吸道疾病的管理策略旨在通過使用抗菌劑和疫苗接種計劃來減少病原體[49]。然而，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中預(yù)防性使用抗菌藥物引起了公眾和學(xué)者的關(guān)注。并且，由于存在病原體免疫抑制等原因，當(dāng)前的疫苗也不能完全預(yù)防感染[1]，因此尋找其他的防止方法是非常重要的。

與前文所述的機會性致病菌不同，呼吸道中一些特定共生菌對犢牛呼吸道健康有積極影響，可防止呼吸道病原體定植下呼吸道黏膜、抑制病原體生長等[16]，也因此有了“呼吸益生菌”這一概念。進入飼養(yǎng)場時，鼻腔中乳酸桿菌科與芽孢桿菌科的成員豐度較高的犢牛發(fā)生BRDC的幾率較小[12]。將健康牛與患有BRDC的牛氣管微生物區(qū)系進行比較，健康牛具有更多的殊異支原體(Mycoplasmadispar)，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)[32。這一保護性過程可能是通過競爭效應(yīng)、改善局部環(huán)境、激活抗菌分子的產(chǎn)生以及調(diào)節(jié)黏膜炎癥來實現(xiàn)的[35]。就競爭效應(yīng)來說，一些乳酸菌在牛支氣管上皮細胞的黏附能力強于牛支原體[50]；就改善微環(huán)境以及產(chǎn)生抗菌分子來說，人類口腔中的唾液鏈球菌可通過產(chǎn)生細菌素來抑制上呼吸道中致病性釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的生長[51]；就調(diào)節(jié)黏膜炎癥來說，共生菌可增強對病原體的定植抵抗力，研究者發(fā)現(xiàn)共生唾液鏈球菌抑制了人支氣管上皮細胞的炎癥反應(yīng)(即下調(diào)了NF-κB途徑)，促進了宿主微生物的穩(wěn)態(tài)[52]。共生菌群還可通過激活炎癥小體來調(diào)節(jié)呼吸道黏膜免疫力[53]。雖然缺乏直接的證據(jù)表明以上機制也發(fā)生在犢牛呼吸道中，但越來越的的相關(guān)研究已經(jīng)在進行中。

多樣化且穩(wěn)定的微生物區(qū)系有助于抵抗病原體的侵襲[54]。兒童上呼吸道感染急性中耳炎相關(guān)病原菌與微生物區(qū)系多樣性偏低相關(guān)[55]；紊亂的微生物區(qū)系可導(dǎo)致人類嬰兒更容易發(fā)生疾病[56]。比較了健康牛與患BRDC牛的呼吸道微生物區(qū)系差異，發(fā)現(xiàn)它們在類、屬、門水平上存在顯著差異，且患病牛的微生物區(qū)系多樣性大都偏低，并在疾病易感期發(fā)生紊亂[16,29,34-35,57-58]。然而致病菌的過度生長本身就可影響微生物區(qū)系多樣性及穩(wěn)定性，因此并沒有證據(jù)可說明微生物區(qū)系的穩(wěn)定性與多樣性與BRDC直接相關(guān)。但不可否認的是上述發(fā)現(xiàn)進一步支持了微生物生態(tài)失調(diào)可影響牛的整體健康理論，并證明了研究牛呼吸道微生物區(qū)系的必要性。

4 展望

盡管目前已經(jīng)有許多的工作來探討微生物區(qū)系與BRDC之間的關(guān)聯(lián)，但這一研究領(lǐng)域?qū)τ跈C制的探索僅僅處于初始階段。呼吸生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性、高通量測序中可能存在的誤差(如樣品污染)限制了對微生物定植、共生機制的理解，并最終導(dǎo)致難以確切描述微生物對呼吸黏膜健康及變化的貢獻。至今已分析了呼吸道中的微生物區(qū)系組成和多樣性，下一步的任務(wù)是通過組學(xué)技術(shù)從功能上表征呼吸道微生物區(qū)系。最后，需要進一步研究來揭示呼吸道微生物區(qū)系對黏膜健康和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的具體作用，可為替代療法的尋找指明方向。