田仰清，郭 娟，汪婭媛，嚴(yán) 涵，昂艷芬，閆曉霞，嚴(yán)玉霖*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南西雙版納州動物疫病預(yù)防控制中心，云南景洪 666100)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)不僅可多向分化、自我增殖，還具有分離難度較低、組織來源豐富、同種異源注射免疫排斥反應(yīng)小等優(yōu)點[1]，在臨床醫(yī)療中具有極大的潛能和研究價值，而以犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(canine bone mesenchymal stem cells,cBMSCs)為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)是獸醫(yī)學(xué)研究的熱點和前沿領(lǐng)域[2]。骨髓是機體內(nèi)BMSCs含量最豐富的組織，但骨髓有核細(xì)胞中BMSCs數(shù)量極少，僅占細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.1%[3]，且在分離傳代過程中BMSCs會逐漸老化喪失多能性，嚴(yán)重影響細(xì)胞定向分化的效率及增殖[4]。因此，探索并認(rèn)識影響B(tài)MSCs多能性的外在條件和內(nèi)在機制是目前急需解決的關(guān)鍵問題。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)也稱為應(yīng)激激活蛋白激酶，是哺乳類細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的另一亞類。當(dāng)生物因素(如α干擾素、白介素1、細(xì)胞內(nèi)毒素)、物理因素(如電離輻射、滲透壓、紫外線、高溫)等因素的干擾機體時，將會活化JNK信號通路。JNK信號通路參與細(xì)胞增殖和分化、形態(tài)維持、骨骼構(gòu)建、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化等生物反應(yīng)，在細(xì)胞增殖、分化和應(yīng)激中也發(fā)揮重要作用[5-6]。

SP 600125是JNK信號通路的可逆ATP競爭性抑制劑[7-8]，可有效抑制JNK信號通路中相關(guān)基因的表達(dá)。JNK信號通路在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用，有研究報道，雷帕霉素通過抑制JNK信號通路，可以促進牙髓干細(xì)胞的增殖和成骨分化[9]，還有其他研究結(jié)果表明通過調(diào)控JNK信號通路，可以促進肌腱干細(xì)胞成骨分化[10]，若能通過抑制JNK信號通路使cBMSCs多能性基因表達(dá)上調(diào)，對解決cBMSCs在分離傳代過程中逐漸老化喪失多能性的問題具有重要意義。本研究通過添加SP 600125達(dá)到抑制JNK信號通路的目的，探討JNK信號通路對cBMSCs多能性基因的影響，對維持cBMSCs多能性以及臨床使用中優(yōu)化干細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗犬 3月齡雄性實驗用健康比格犬，購自青島博隆比格犬養(yǎng)殖有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基，Gibico公司產(chǎn)品；TritonX-100，德國Biofroxx公司產(chǎn)品；MTT，中國Biosharp公司產(chǎn)品；Anti-Canine CD 44 APC、CD 34 PE、CD 45-FITC、CD 11 a-FITC，美國eBioscience公司產(chǎn)品；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品；Bio-Rad-Cfx熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱、Thermo生物安全柜，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Bio-Tek ELx800吸收光酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定及分組 犬麻醉后，在無菌狀態(tài)下抽取骨髓，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實驗室參照專利“同時分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和多功能造血干細(xì)胞的方法”(專利號ZL 201410405353.X)分離間充質(zhì)干細(xì)胞，并以適宜的細(xì)胞密度(1×106～5×106/mL)接種至培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換一次液，長至80%～90%進行傳代。cBMSCs培養(yǎng)傳至第3代，添加抗CD34、CD44、CD45、CD90和CD11a熒光標(biāo)記單克隆抗體，使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面標(biāo)記進行鑒定。取第3代細(xì)胞進行試驗，通過MTT試驗計算得到SP 600125的最適濃度，試驗分為對照組(普通培養(yǎng)基)，抑制組(添加10-6mol/L SP 600125的普通培養(yǎng)基)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性 MTT法參照GB/T16886.5-2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評價5部分:體外細(xì)胞毒性試驗》，通過MTT試驗計算得到SP 600125對cBMSCs的最適試驗濃度，在最適藥物濃度下測定對照組及抑制組的細(xì)胞活性情況。將3代細(xì)胞培養(yǎng)第7、14、21天的細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)移至96孔板，加入培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱孵育觀察細(xì)胞情況，加入MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)二甲基亞砜處理后使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光值，即OD值。

1.2.3 熒光定量PCR 從培養(yǎng)瓶中收集第7、14、21天的3代細(xì)胞，使用TRIzol法提取總RNA。將起始RNA統(tǒng)一定量為1 000 ng，按照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將完整性良好的RNA模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有步驟均在冰上操作，所得cDNA 置于-20 ℃保存待用。

根據(jù)GenBank中C3肉瘤毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,RAC1)、激活轉(zhuǎn)錄因子2(Activating transcription factor 2,ATF2)、性別決定基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(SRY related high mobility group box 2,Sox2)、多能性相關(guān)基因多梳蛋白4(chromobox homolog 4,CBX4)基因序列，采用 Primer Premier6.0、Oligo 6.0軟件設(shè)計特異引物，引物序列如表1所示。

表1 熒光定量PCR引物序列

以GAPDH基因作為內(nèi)參，利用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行熒光定量PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)體系(20 μL):TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL；上、下游引物各(10 μmol/L)0.8 μL；DNA 模板2 μL；dH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序:5 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，50 ℃～60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，擴增共40個循環(huán)。

1.2.4 ELISA法檢測細(xì)胞上清液蛋白含量 從培養(yǎng)瓶中收集第7、14、21天的3代細(xì)胞上清液，使用ELISA試劑盒測上清液蛋白濃度。按照Canine CBX 4 ELISA試劑盒和Canine SOX 2 ELISA試劑盒說明書添加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各孔吸光值(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

2.1.1 分離培養(yǎng)原代cBMSCs形態(tài)觀察 相差顯微鏡下觀察分離得到的原代cBMSCs細(xì)胞形態(tài)及生長情況，在第11天時培養(yǎng)瓶中以先變形細(xì)胞為中心出現(xiàn)短梭形細(xì)胞且細(xì)胞團明顯呈漩渦狀貼壁聚集生長(圖1)。

A.3 d;B.5 d;C.11 d

2.1.2 cBMSCs 表型鑒定結(jié)果 取第3代cBMSCs進行流式細(xì)胞術(shù)分析，CD44和CD90強陽性，CD34、CD11a、CD45為陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物特點(圖2)。

圖2 細(xì)胞表面標(biāo)記流式鑒定結(jié)果

2.2 MTT 檢測結(jié)果

2組細(xì)胞增殖率由圖3可知，抑制組在第7天極顯著高于對照組(P<0.01)，在第14天顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 各組cBMSCs細(xì)胞增長率

2.3 熒光定量PCR法檢測結(jié)果

2.3.1 cBMSCs中RAC1 mRNA表達(dá)情況 從圖4可知，抑制組RAC1 mRNA表達(dá)水平在第7天時顯著低于對照組(P<0.05)，在第14、21天均極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖4 各組cBMSCs RAC 1 mRNA表達(dá)水平的比較

2.3.2 cBMSCs中ATF2 mRNA表達(dá)情況 從圖5可知，抑制組ATF2 mRNA表達(dá)水平在所有時間點均極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖5 各組cBMSCs ATF 2 mRNA表達(dá)水平的比較

2.3.3 cBMSCs中CBX4 mRNA表達(dá)情況 從圖6可知，抑制組CBX4 mRNA相對表達(dá)水平在3個時間點均極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖6 各組cBMSCs CBX 4 mRNA表達(dá)水平的比較

2.3.4 cBMSCs 中Sox2 mRNA表達(dá)情況 從圖7可知，抑制組Sox2 mRNA相對表達(dá)水平在3個時間點均極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖7 各組cBMSCs Sox 2 mRNA表達(dá)水平的比較

2.4 ELISA法檢測結(jié)果

2.4.1 cBMSCs細(xì)胞上清液中CBX 4蛋白含量

2.4.1.1 CBX 4標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 由CBX 4的標(biāo)準(zhǔn)品得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示，回歸方程為y=0.032 4x-0.020 3，R2= 0.997 4，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求。

圖8 CBX 4 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.1.2 CBX 4含量變化 從圖9可知，與對照組比較，cBMSCs上清液中除第14天的抑制組，第7、21天均極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖9 各組cBMSCs培養(yǎng)基上清中CBX 4含量

2.4.2 cBMSCs細(xì)胞上清液中Sox 2蛋白含量

2.4.2.1 Sox 2標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 由Sox 2的標(biāo)準(zhǔn)品得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖10所示，回歸方程為y=0.077 3x+0.019 6，R2= 0.999 6，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求。

圖10 Sox 2 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2.2 Sox 2含量變化 從圖11可知，抑制組Sox 2蛋白含量在3個時間點均極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖11 各組cBMSCs 培養(yǎng)基上清中Sox 2含量

3 討論

BMSCs的多能性即增殖和分化能力，在臨床治療中起著關(guān)鍵作用，但隨著BMSCs的衰老，BMSCs的多能性會逐漸喪失，嚴(yán)重影響治療效果[11-12]。多能性相關(guān)基因CBX4、Sox2對BMSCs多能性的維持具有重要作用。CBX4可指示BMSCs的衰老情況，CBX4是核心蛋白復(fù)合體 1(polycomb complex 1,PRC1)的組成部分，參與維持核仁異染色質(zhì)過程，在維持細(xì)胞身份和器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用[13]，核仁與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及衰老調(diào)節(jié)相關(guān)。過表達(dá)CBX4可減輕人MSC 的衰老，而CBX4缺乏時細(xì)胞衰老加速。研究表明，衰老小鼠體內(nèi)CBX4基因過表達(dá)時，小鼠MSC的衰老現(xiàn)象減輕，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生幾率變小，除此之外還有研究報道CBX4可減緩維持人表皮干細(xì)胞分化過程延緩細(xì)胞衰老[14-15]。Sox2基因是Sox家族的重要成員之一，與MSCs的自我更新及分化潛能密切相關(guān)，在MSCs的分化多能性維持和細(xì)胞生長等生理過程中起重要調(diào)節(jié)作用[16-17]。

JNK信號通路在調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡等一系列不同的生理過程中發(fā)揮重要作用，RAC1、ATF2是JNK信號通路中下游通路因子。RAC1是一種小分子 GTP酶，可調(diào)控JNK信號通路[18-19]。眾所周知在臨床骨髓疾病中RAC1的量還指示著炎癥的情況，與巨噬細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)，研究中抑制組RAC1 mRNA表達(dá)水平在第14、21天時低于對照組的程度比第7天更為明顯，推測可能是因前期分離的細(xì)胞中含有少量巨噬細(xì)胞引起的。JNK介導(dǎo)ATF2磷酸化增強其轉(zhuǎn)錄活性，c-Jun磷酸化的誘導(dǎo)對于許多不同的細(xì)胞增殖、凋亡過程以及癌癥細(xì)胞的調(diào)節(jié)非常重要[20-21]。有研究報道ATF2具有抑制癌細(xì)胞和促進癌細(xì)胞的雙重作用。相較于正常細(xì)胞，在癌變的腎細(xì)胞中ATF2的表達(dá)量更高；當(dāng)敲除癌變腎細(xì)胞中的ATF2 時，癌細(xì)胞的增殖與遷徙能力明顯降低[20]，SP 600125組在培養(yǎng)過程中相較于對照組表現(xiàn)出更好的增殖情況，其中機制可能與ATF2的表達(dá)減少有關(guān)。

本研究中抑制組由于添加了JNK信號通路抑制劑，JNK信號通路相關(guān)基因RAC1、ATF2的mRNA表達(dá)水平降低。抑制JNK信號通路后，多能性相關(guān)基因CBX4、Sox2 mRNA的表達(dá)水平增加，表明cBMSCs細(xì)胞狀態(tài)保持“年輕態(tài)”，細(xì)胞衰老情況得以緩解，提示JNK信號通路可能是維持cBMSCs多能性的分子機制之一。

綜上所述，cBMSCs多能性可使細(xì)胞維持增殖及分化能力，而抑制JNK信號通路可維持cBMSCs的多能性，但其中的作用機制還需更深一步的研究。