劉程媛，賈延德，張富強(qiáng)，紀(jì)甜甜，王天星，姜悅才，趙慧英*，陳德坤*，馬文濤*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西寧市湟中區(qū)畜牧獸醫(yī)站，青海西寧 810099；3.陜西千陽(yáng)莎能奶山羊發(fā)展有限公司，陜西千陽(yáng) 721100)

乳房炎(Mastitis)是由病原微生物感染乳腺組織引起的炎癥性疾病，常發(fā)生于泌乳動(dòng)物。通常根據(jù)乳汁及乳房有無(wú)可見(jiàn)異常，將乳房炎分為臨床乳房炎和隱性乳房炎[1]。臨床乳房炎發(fā)病迅速，在2 d～3 d內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致奶山羊乳房壞死甚至死亡，但其發(fā)病率較低，約為2%[2]。隱性乳房炎由于無(wú)肉眼可見(jiàn)的癥狀常被飼養(yǎng)者忽視，但會(huì)導(dǎo)致乳汁中體細(xì)胞數(shù)量升高、乳汁品質(zhì)降低和患畜產(chǎn)奶量降低[3-5]。在不同奶山羊養(yǎng)殖企業(yè)中，由于養(yǎng)殖規(guī)模、管理水平、所處地區(qū)的流行情況等不同，導(dǎo)致隱性乳房炎的發(fā)病率差異較大，一般在30%～80%[6-7]。調(diào)查顯示，陜西省奶山羊隱性乳房炎的發(fā)病率約為45.5%[8]。陜西是我國(guó)奶山羊的主要養(yǎng)殖省份之一，奶山羊產(chǎn)業(yè)是陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的重要支柱。乳房炎不僅對(duì)奶山羊養(yǎng)殖企業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，乳房炎羊乳中的病原微生物及其治療產(chǎn)生的抗菌藥物殘留也對(duì)人類健康和食品安全構(gòu)成了一定的威脅。然而，目前尚無(wú)商品化的有效的奶山羊乳房炎疫苗[9-10]。因此，奶山羊乳房炎的預(yù)防和治療是亟待解決的一個(gè)棘手問(wèn)題，對(duì)于陜西省打造“千億羊乳”工程具有重要意義。我們從陜西省武功縣某奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)乳房炎乳汁中分離出2種主要病原菌，制備了二聯(lián)滅活疫苗并評(píng)估了免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 陜西省武功縣某奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)的成年泌乳期關(guān)中奶山羊32只。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；可溶性單組分TMB底物溶液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GelRed核酸染料，蘭杰柯科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、2×TaqMaster Mix，西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；隱性乳房炎診斷液、轉(zhuǎn)移因子，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗(兔抗羊IgG-HRP)，Abcam公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(T100)，上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)(Avanti JXN-30)，德國(guó)Eppendorf生命科技公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；恒溫空氣浴搖床(HNY-2102C)，天津歐諾儀器股份有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)，蘇州蘇凈集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；超聲破碎儀(IMS-30)，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀(Spark)，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(K8420)，南京世研儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 乳樣采集及乳房炎檢測(cè) 采集乳樣時(shí)先將奶山羊乳房擦洗干凈，對(duì)乳頭和采樣者雙手進(jìn)行充分消毒后，棄去前2把～3把乳并采集約7 mL乳汁于離心管中，標(biāo)記樣品編號(hào)。診斷隱性乳房炎時(shí)，將診斷液和乳樣各5 mL加于乳房炎診斷盤中，然后作水平同心圓狀搖動(dòng)約5 s，使診斷液和乳樣混合均勻，觀察并記錄診斷結(jié)果。診斷后的乳樣，置于冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離鑒定和抗體效價(jià)檢測(cè)。

1.2.2 病原菌分離純化 參照常規(guī)的細(xì)菌分離方法進(jìn)行[11]。主要操作程序是用接種環(huán)取乳房炎乳汁接種于山羊血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h～36 h后，觀察并記錄菌落特征。挑取典型菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃空氣浴搖床過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。再用接種環(huán)取菌液劃線接種于山羊血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并進(jìn)行純化鑒定。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察 純化的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、山羊血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h～48 h。觀察并記錄細(xì)菌的生長(zhǎng)情況、菌落的大小、形態(tài)、溶血性等特征。取菌液涂片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察并記錄細(xì)菌的形態(tài)、大小、染色情況等。

1.2.3.2 分離菌16S rDNA片段擴(kuò)增與序列比對(duì) 挑取單克隆菌落于50 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR中充分混勻，80 ℃水浴15 min，低速離心，上清液即為細(xì)菌的基因組DNA，將其作為模板用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，DNA模板 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。將電泳鑒定結(jié)果與預(yù)期相符的PCR產(chǎn)物送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。將測(cè)得的序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast程序與收錄的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3.3 分離菌基因組特異性序列的PCR擴(kuò)增 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的特異性引物序列合成上、下游引物[12]。進(jìn)行基因組特異性序列的PCR擴(kuò)增并將PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，特異性PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.4 細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng) 將菌株分別接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃空氣浴搖床過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。再將擴(kuò)菌后的菌液接入裝有500 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃空氣浴搖床振蕩培養(yǎng)12 h～18 h至菌液密度為1×109CFU/mL，離心，收集菌體沉淀。

1.2.5 細(xì)菌的滅活及滅活效果檢測(cè) 用適量的無(wú)菌生理鹽水以8 000 r/min室溫離心10 min后棄去上清的方法，將1.2.4中獲得的菌體沉淀洗滌3次，再用500 mL含50 mg/mL甲醛的生理鹽水將菌體沉淀重懸，置于37 ℃空氣浴搖床中振蕩滅菌處理，大腸埃希氏菌處理72 h，金黃色葡萄球菌處理96 h。

取100 μL滅活后的菌液涂布普通瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。若平板上無(wú)菌落形成，證明滅活成功；否則繼續(xù)振蕩滅菌。

1.2.6 鋁膠鹽-轉(zhuǎn)移因子佐劑的制備 先配制50 mg/mL的硫酸鋁溶液：稱取25 g硫酸鋁粉加入250 mL蒸餾水中充分混勻；再配制50 mg/mL的氫氧化鈉溶液：稱取5 g氫氧化鈉粉末加入100 mL蒸餾水中充分混勻。然后將這兩種溶液充分混勻后在室溫下靜置，待其自然沉降分層后，用生理鹽水洗滌2次。最后，用本實(shí)驗(yàn)室制備的轉(zhuǎn)移因子將其定容到500 mL，即為鋁膠鹽-轉(zhuǎn)移因子佐劑。

1.2.7 二聯(lián)滅活疫苗的制備 將500 mL滅活好的菌液用適量的無(wú)菌生理鹽水洗滌3次以除去甲醛，再用500 mL無(wú)菌生理鹽水重懸起來(lái)。將兩種菌液按照1∶1的比例混合，再將混合菌液與鋁膠鹽-轉(zhuǎn)移因子佐劑等體積充分混勻，即得奶山羊乳房炎二聯(lián)滅活疫苗，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 奶山羊免疫試驗(yàn) 對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的全部泌乳期奶山羊進(jìn)行隱性乳房炎檢測(cè)，隨機(jī)選取其中的32只進(jìn)行乳房炎滅活疫苗的免疫試驗(yàn)。將其分為疫苗免疫組和對(duì)照組，每組16只(其中乳房炎陽(yáng)性和陰性的奶山羊各8只)。對(duì)照組不做任何處理，免疫組動(dòng)物頸部皮下注射疫苗2 mL/只，并在首免后第15天以相同的方式和劑量進(jìn)行第2次免疫。

在免疫前、二免后第0、15、35、60天采集所有奶山羊的血液和乳汁樣本，分離血清和乳清保存于-20 ℃，用于抗體效價(jià)的測(cè)定。

1.2.9 試驗(yàn)羊的抗體測(cè)定和體細(xì)胞檢測(cè) 參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[13]進(jìn)行。測(cè)定結(jié)果用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

從奶山羊乳房炎乳汁中分離純化出的病原菌，按照其菌落形態(tài)特征(圖1)和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(圖2)，可以分為2類：

A.A類細(xì)菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B.B類細(xì)菌在金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

A.A類細(xì)菌；B.B類細(xì)菌

A類菌落：在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑、濕潤(rùn)、灰白色的圓形菌落；在山羊血瓊脂平板上部分菌株有溶血現(xiàn)象；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色的菌落。革蘭氏染色呈陰性，無(wú)莢膜、無(wú)芽孢，短小桿狀、兩端鈍圓，單個(gè)或成對(duì)排列。

B類菌落：在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑、濕潤(rùn)、黃色的圓形菌落；在金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基上形成黑色、有光澤的圓形菌落，其周圍有不透明圈，最外有清晰帶。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)莢膜、無(wú)芽孢，圓形，呈葡萄串狀排列。

2.2 分離菌16S rDNA的序列比對(duì)

測(cè)得分離菌16S rDNA序列的相似性比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。比對(duì)結(jié)果顯示A類細(xì)菌為大腸埃希氏菌，B類細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。兩者與對(duì)應(yīng)的收錄序列的相似性均超過(guò)99.9%。

表1 分離菌16S rDNA的序列比對(duì)結(jié)果

2.3 分離菌基因組特異性序列的PCR擴(kuò)增

以分離菌基因組DNA為模板，用對(duì)應(yīng)的細(xì)菌特異性引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。該結(jié)果表明，A類細(xì)菌為大腸埃希氏菌，B類細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.A類細(xì)菌；2.陰性對(duì)照;3.B類細(xì)菌

2.4 乳房炎二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的評(píng)估

在二免后的60 d內(nèi)，免疫組奶山羊血清中針對(duì)兩種病原菌的抗體水平均顯著升高(P<0.05)，而對(duì)照組變化不顯著，結(jié)果見(jiàn)圖4～圖7。二免后第15天，免疫組血清中的抗體效價(jià)達(dá)到峰值，約為210，為對(duì)照組的32倍。之后血清中的抗體效價(jià)略有下降，但仍顯著高于對(duì)照組。乳清中的抗體效價(jià)與血清類似，在二免后60 d內(nèi)顯著升高，在二免后第15天達(dá)到峰值，且乳清中的抗體效價(jià)總是略高于血清中的抗體效價(jià)。

圖4 血清中大腸埃希氏菌的抗體效價(jià)

圖5 血清中金黃色葡萄球菌的抗體效價(jià)

圖6 乳清中大腸埃希氏菌的抗體效價(jià)

圖7 乳清中金黃色葡萄球菌的抗體效價(jià)

在二免后60 d內(nèi)，用CMT診斷液對(duì)對(duì)照組和免疫組的奶山羊進(jìn)行隱性乳房炎的檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)照組奶山羊隱性乳房炎的檢出率始終維持在40%以上；相比而言，免疫組的隱性乳房炎檢出率顯著下降：免疫前的檢出率為50%，在二免時(shí)下降到了18.75%，在二免后第35天下降到6.25%(圖8)。以上結(jié)果表明，本研究制備的乳房炎滅活二聯(lián)疫苗對(duì)奶山羊隱性乳房炎的治療效果顯著。

圖8 隱性乳房炎檢出率

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)陜西、山東、云南省3個(gè)主要奶山羊養(yǎng)殖地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌分別占我國(guó)奶山羊乳房炎病原菌的17%和16%。這與國(guó)際上的病原學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果高度一致，即大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌是奶山羊乳房炎最主要的病原菌[7,14]。因此，本研究以武功奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)乳房炎乳中分離出的這2種病原菌為材料，制備乳房炎二聯(lián)滅活疫苗并評(píng)估其免疫效果，以期為奶山羊乳房炎的防治提供參考。

乳房炎的主要病原菌都屬于胞外寄生菌，因此體液免疫對(duì)于病原菌的清除具有重要意義。乳腺組織體液免疫產(chǎn)生的抗體不僅能通過(guò)凝集作用抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)及其對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的吸附，也可以通過(guò)與補(bǔ)體結(jié)合發(fā)揮溶菌和調(diào)理作用[15-16]。因此，測(cè)定免疫后特異性抗體的效價(jià)是評(píng)估疫苗免疫效果的關(guān)鍵指標(biāo)之一。本研究中，二免后60 d內(nèi)免疫組血清和乳清中針對(duì)2種分離菌的抗體效價(jià)均顯著高于對(duì)照組，效價(jià)最高時(shí)約為對(duì)照組的32倍，表明該疫苗能有效刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫。免疫前隱性乳房炎檢出率為50%，在二免后第35天下降到6.25%。本實(shí)驗(yàn)室同時(shí)用上述的免疫方法對(duì)其他羊群免疫后發(fā)現(xiàn)，1只患有臨床乳房炎的奶山羊，其乳汁由免疫前的紫黑色在二免后第35天轉(zhuǎn)為了乳白色。隱性乳房炎檢出率的顯著降低和臨床乳房炎病情的改善，表明該疫苗對(duì)乳房炎還具有一定的治療作用，但其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究闡明。