劉冬霞，張淑霞，徐海玲，許信剛，張 琪

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

乳房炎(Mastitis)是奶牛疾病中對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)影響較大的一種疾病，可導(dǎo)致乳制品行業(yè)的大量生產(chǎn)損失[1]。乳房炎通常是宿主對(duì)乳房?jī)?nèi)感染的反映，由大量細(xì)菌感染引起[2]。目前引起牛乳房炎的病原主要為革蘭氏陰性菌，如大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌，以及革蘭氏陽性菌，如無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，這些微生物中的大多數(shù)也作為人類的病原體出現(xiàn)[3-6]。準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)有效的乳房炎病原體檢測(cè)對(duì)于奶牛乳房炎的診斷、監(jiān)測(cè)和控制非常重要。乳汁微生物鑒定常被認(rèn)為是乳房炎診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該方法盡管較為準(zhǔn)確，但耗時(shí)較長(zhǎng)、方法繁瑣、敏感性較低，故而難以滿足臨床需要。此外，許多病原體具有共同的形態(tài)特征，并在患病牛中引起相似的臨床癥狀，通過培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速診斷多發(fā)性和繼發(fā)性感染存在困難的，而不依賴于病原菌培養(yǎng)的多重PCR技術(shù)因其快速、特異性地同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)菌物種的特點(diǎn)已成為奶牛乳房炎病原菌檢測(cè)的主流手段[7-8]。本研究通過比對(duì)分析，針對(duì)奶牛乳房炎臨床常見致病菌如大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌的相對(duì)保守基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立和評(píng)估了多重PCR檢測(cè)方法，為早期診斷和臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、蠟樣芽孢桿菌、牛棒狀桿菌、乳房鏈球菌、糞腸球菌和表皮葡萄球菌，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 2×EsTaqMasterMix、DNA標(biāo)準(zhǔn)、瓊脂糖、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；引物由奧科鼎盛生物科技有限公司合成；血清瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和肉湯培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[9]方法配制。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR儀(K960)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYCP-31DHDYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(SJ-CJ-1FD)，蘇潔醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-50HJ)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的大腸埃希氏菌phoA基因(序列號(hào)：M13345.1)、金黃色葡萄球菌nuc基因(序列號(hào)：CP029087.1)、無乳鏈球菌tuf基因(序列號(hào)：AF276256.1)、肺炎克雷伯氏菌khe基因(序列號(hào)：KX842080.1)，利用Primer 5.0分析軟件，設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，由奧科鼎盛生物科技有限公司合成(表1)。

表1 多重PCR引物

1.2.2 模板DNA的制備 細(xì)菌純培養(yǎng)物按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 單項(xiàng)引物PCR擴(kuò)增及鑒定 以上述方法提取的4個(gè)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足。按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，94 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取0.5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)多次試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響多重PCR反應(yīng)結(jié)果的因素主要是退火溫度和引物濃度，因此本試驗(yàn)對(duì)這兩個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。將大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA等量混勻作為模板。將退火溫度按照2 ℃梯度設(shè)定為51.8、54.1L、56.2L、58.5L、59.7L、62.0 ℃進(jìn)行試驗(yàn)；按照0.25 μmol/L的濃度梯度設(shè)定各對(duì)引物濃度組合分別為(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μmol/L)進(jìn)行優(yōu)化，篩選多重PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 以上述方法提取的4個(gè)菌基因組DNA混合物作為模板，以非目標(biāo)菌株基因組DNA和雙蒸水作為對(duì)照，每孔均加入4對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)多重PCR反應(yīng)的特異性。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 用核酸蛋白定量?jī)x分別測(cè)得大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌DNA模板的質(zhì)量濃度分別為 171.1、191.6、109.6、208.9 ng/μL，將已測(cè)定濃度的4種菌的模板DNA按101～109梯度進(jìn)行稀釋，在優(yōu)化好的多重PCR體系下進(jìn)行擴(kuò)增，觀察單項(xiàng)PCR和多重PCR擴(kuò)增的靈敏度。

1.2.7 臨床奶樣檢測(cè) 陜西地區(qū)部分奶牛場(chǎng)送檢了35份臨床奶樣，利用建立的多重PCR檢測(cè)方法和傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16S rRNA測(cè)序分析的方法同時(shí)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，比較二者之間的檢出率及符合率。符合率=(共同陽性數(shù)+共同陰性數(shù))/所檢樣品數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果

單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1，可以分別觀察到666 bp(大腸埃希氏菌)、287 bp(無乳鏈球菌)、477 bp(金黃色葡萄球菌)和209 bp(肺炎克雷伯氏菌)的條帶，大小與預(yù)期相符。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.大腸埃希氏菌；2.無乳鏈球菌；3.金黃色葡萄球菌；4.肺炎克雷伯氏菌

2.2 多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

對(duì)引物的濃度和退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化。多重PCR反應(yīng)體系中各對(duì)引物終濃度各為1.0 μmol/L時(shí)最佳(圖2)；最適退火溫度為56.2 ℃(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.0.25 μL；2.0.5 μL；3.0.75 μL；4.1.0 μL；5.1.25 μL；6.1.5 μL

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.51.8 ℃；2.54.1 ℃；3.5 6.2 ℃；4.58.5 ℃；5.59.7 ℃；6.62 ℃

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

使用4個(gè)引物對(duì)的引物混合物通過多重PCR擴(kuò)增目標(biāo)菌株和非目標(biāo)菌株的基因組DNA(圖4)，結(jié)果多重PCR測(cè)定分別為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌的均能擴(kuò)增出666、477、287、209 bp的目的條帶，而非目標(biāo)菌株未觀察到條帶。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.大腸埃希氏菌+金黃色葡萄球菌+無乳鏈球菌+肺炎克雷伯氏菌；2.大腸埃希氏菌；3.金黃色葡萄球菌；4.無乳鏈球菌；5.肺炎克雷伯氏菌；6.蠟樣芽孢桿菌；7.牛棒狀桿菌；8.乳房鏈球菌；9.糞腸球菌；10.表皮葡萄球菌；11.陰性對(duì)照

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將提取的細(xì)菌基因組DNA混合后倍比稀釋，利用優(yōu)化好的多重PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，分別測(cè)出多重PCR對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌DNA模板最低檢出限分別為17.11、19.16、109.6、20.89 pg/μL(圖5A)，單項(xiàng)PCR檢測(cè)最低量分別為大腸埃希氏菌1.711 pg/μL、金黃色葡萄球菌0.191 pg/μL、無乳鏈球菌1.096 pg/μL、肺炎克雷伯氏菌2.089 pg/μL(圖5B、圖5C、圖5D、圖5E)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～9.101～109倍比稀釋DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果；A.大腸埃希氏菌+金黃色葡萄球菌+無乳鏈球菌+肺炎克雷伯氏菌；B.大腸埃希氏菌；C.金黃色葡萄球菌；D.無乳鏈球菌；E.肺炎克雷伯氏菌

2.5 臨床樣本檢測(cè)

對(duì)35份的送檢樣品同時(shí)進(jìn)行多重PCR及細(xì)菌分離鑒定進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2；部分樣品多重PCR檢測(cè)結(jié)果見圖6。多重PCR檢測(cè)技術(shù)的陽性檢出率為51.4%，細(xì)菌分離鑒定檢出的陽性率為45.7%，兩種方法同時(shí)檢測(cè)4種病原菌檢出的符合率為94.3%。

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～10樣品

3 討論

乳房炎因其高患病率和高發(fā)病率已成為危害全球奶牛健康最重要的疾病之一。多項(xiàng)研究證實(shí)了乳房炎對(duì)畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性和危害性[10]。近年來，國(guó)內(nèi)對(duì)于奶牛乳房炎防治手段的研究在逐漸進(jìn)步，但是還沒有一種有效手段能對(duì)奶牛乳房炎進(jìn)行預(yù)防和治療，奶牛乳房炎發(fā)病率依然保持很高的水平。研究表明，可引起奶牛乳房炎的細(xì)菌多達(dá)上百種，乳房炎致病菌檢測(cè)或鑒定不及時(shí)往往會(huì)延誤疾病的治療。因此建立一種針對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌的診斷方法就顯得尤為迫切。目前，PCR已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病原的檢測(cè)，尤其是多重PCR技術(shù)的出現(xiàn)更是極大地滿足了臨床檢測(cè)需要[11-12]。本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法選取的大腸埃希氏菌phoA基因，金黃色葡萄球菌nuc基因，無乳鏈球菌tuf基因，肺炎克雷伯氏菌khe基因都具有高度保守又廣泛存在的特點(diǎn)。根據(jù)以上基因設(shè)計(jì)的4對(duì)特異性引物，擴(kuò)增出來的片段均正確且特異性良好。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，多重PCR方法的靈敏度比單項(xiàng)PCR方法的相比降低了101～102倍，這可能是引物間的相互影響引起的，但已經(jīng)能滿足臨床檢測(cè)的需要。該方法可用于細(xì)菌培養(yǎng)物或臨床樣本，均能準(zhǔn)確地鑒定病原菌。所建立分子檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)臨床收集的35份樣本檢測(cè)中得到了驗(yàn)證(表2)。應(yīng)用這種方法可以繼純培養(yǎng)物或臨床樣本中簡(jiǎn)單提取基因組DNA后，在1個(gè)工作日內(nèi)確定出奶牛乳房炎感染的致病菌。

綜上，本試驗(yàn)建立的多重PCR方法可以快速、特異性地診斷由主要致病菌大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌單獨(dú)或混合感染引起的奶牛乳房炎，且靈敏度高，能滿足臨床檢測(cè)的需要，為臨床感染用藥提供指導(dǎo)。同時(shí)應(yīng)用該方法可以了解牛群的健康狀態(tài)，為提高群體健康管理的質(zhì)量和精確度提供參考。