黃光明，趙興昌，符顯昭

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣西 百色 533000）

成人心肌細(xì)胞在心室區(qū)域中占比高達(dá)49%[1]，是心臟發(fā)揮泵血功能的關(guān)鍵細(xì)胞，而糖尿病狀態(tài)下的高血糖、高血脂、氧化應(yīng)激等病理因素易誘發(fā)心肌細(xì)胞過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），造成心肌凋亡[2]。心肌細(xì)胞凋亡將促發(fā)凋亡區(qū)域的心肌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的一系列代償性病理改變，導(dǎo)致心臟重塑發(fā)生與進(jìn)展[3]。心臟重塑嚴(yán)重危害心臟結(jié)構(gòu)與功能，是各種心血管疾病進(jìn)展至心力衰竭的關(guān)鍵性病理改變[4]。目前臨床治療主要以降糖藥物防控糖尿病及其心血管并發(fā)癥進(jìn)展，但無論發(fā)展中還是發(fā)達(dá)國家，糖尿病患者的心力衰竭發(fā)病率依舊居高不下[5]。因此，積極尋找減輕糖尿病下心肌細(xì)胞凋亡的有效方法，抑制心臟重塑發(fā)生與進(jìn)展，對于降低糖尿病患者心力衰竭發(fā)生率意義重大。水中運(yùn)動治療是水療康復(fù)的現(xiàn)代主流技術(shù)方法，可激發(fā)患者興趣，縮減心理障礙，緩解運(yùn)動不耐受，心血管康復(fù)優(yōu)勢明顯[6，7]。中藥內(nèi)治是傳統(tǒng)康復(fù)醫(yī)學(xué)的重要治療方法，越來越多的藥理學(xué)研究和臨床試驗(yàn)都證實(shí)了相關(guān)中藥成分具有抗炎、抗凋亡、調(diào)節(jié)代謝紊亂等多重功效[8]。本實(shí)驗(yàn)擬探究水中運(yùn)動聯(lián)合中藥內(nèi)治對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心功能的影響，為糖尿病合并心血管疾病的防治提供借鑒和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素（北京華越洋生物公司），血糖試紙（武漢博士德生物工程有限公司），高脂飼料（江蘇省協(xié)同生物工程有限公司），TUNEL試劑盒（北京華越洋生物公司），生理鹽水、PBS 緩沖液、二甲苯、乙醇溶液、過氧化氫溶液、4%多聚甲醛（成都市科隆化學(xué)品有限公司），PCR 引物及試劑（上海吉凱基因生物科技有限公司）；Vevo-770 小動物超聲診斷儀，超凈工作臺（山東博科生物科技有限公司），-80 ℃超低溫冰箱（中國海爾），光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司），PCR 儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 動物分組與造模 雄性SD 大鼠125 只，體重（240±10）g[購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證編號SCXK（桂）2014-002]，大鼠飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%。按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白組、模型組、中藥內(nèi)治組、水中運(yùn)動組、綜合康復(fù)組，每組25 只。除空白組外，其余組空腹10 h 后，隨即按照50 mg/kg 腹腔注射鏈脲佐菌素，72 h 后檢測其空腹血糖（FBG）水平，選擇連續(xù)2 次FBG≥16.7 mmol/L 大鼠,高脂飼養(yǎng)3 個月后作為2型糖尿病模型。造模成功后除空白組外各組繼續(xù)高脂飼養(yǎng)（具體成分為：豬膽鹽0.3%、膽固醇1.5%、豬油10%、蛋黃粉10%、普通飼料78.2%），空白組大鼠采用普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案嚴(yán)格遵守美國NIH 下的實(shí)驗(yàn)動物使用指南，并通過右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 水中運(yùn)動方案 水中運(yùn)動組以及綜合康復(fù)組利用自制大鼠水療運(yùn)動池進(jìn)行游泳運(yùn)動，水療運(yùn)動池水深不小于30 cm，維持水溫32 ℃～35 ℃，每次使用前消毒，確保水質(zhì)安全。每周運(yùn)動6 次，第1 周為適應(yīng)期，運(yùn)動時(shí)間為10 min/次，第2 周為延長運(yùn)動適應(yīng)期，運(yùn)動時(shí)間逐漸增至30 min/次，第3～8 周運(yùn)動時(shí)間為60 min/次。

1.4 灌胃處理方案 將中藥復(fù)方（人參、麥冬、黃芪、地黃、大黃、山茱萸、黃連、五味子，購自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）制成浸膏，依據(jù)人與大鼠劑量換算公式確定用藥劑量，配制成混懸液后，中藥內(nèi)治組與綜合康復(fù)組按照1.0 g/（kg·d）灌服混懸液，模型組與水中運(yùn)動組每天給予等體積生理鹽水灌胃處理，連續(xù)灌胃8 周,各組灌胃處理在運(yùn)動前2 h 進(jìn)行。

1.5 超聲心動圖檢測 各組接受相應(yīng)處理8 周后進(jìn)行超聲心動圖檢測，2%異氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉大鼠，仰臥位固定，利用Vevo-770 小動物超聲診斷儀檢測左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、二尖瓣快速充盈期與心房收縮期血流速度比值（E/A）。

1.6 實(shí)驗(yàn)取材 各組接受末次相應(yīng)處理并進(jìn)行超聲心動圖檢測后，麻醉處死大鼠，摘取心臟，分為2 部分，一部分4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于TUNEL 法檢測心肌細(xì)胞凋亡，另一部分存放于-80 ℃液氮保存，用于RT-PCR 實(shí)驗(yàn)。

1.7 TUNEL 法檢測心肌細(xì)胞凋亡 利用二甲苯處理心肌組織石蠟切片10 min，脫蠟后使用乙醇溶液完成水化處理，加入蛋白酶，室溫下15 min，3%過氧化氫溶液處理10 min，按照TUNEL 凋亡檢測試劑盒明配制TUNEL 液；將TUNEL 液添加至切片，37 ℃下反應(yīng)60 min，PBS 沖洗后添加DAB 顯色劑，85%、95%、100%逐級濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，拍照TUNEL 染色大鼠心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果。凋亡陽性心肌細(xì)胞核為黃棕色，正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色,每張切片選擇5 個不重復(fù)視野對細(xì)胞核總數(shù)和凋亡細(xì)胞核數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（cell apoptotic index，CAI）。CAI=凋亡心肌細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%，計(jì)算每個視野內(nèi)的CAI，并取平均值。

1.8 Real time-PCR 測定心肌組織中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12 mRNA)轉(zhuǎn)錄水平 取心肌組織0.1 g，加入液氮研磨后利用Trizol 試劑提取大鼠心肌組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲取目的基因。Real time-PCR 測定GRP78、Caspase-12 mRNA 相對表達(dá)水平，反應(yīng)條件為96 ℃4 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共計(jì)40 個循環(huán)。目的基因的相對表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH，各項(xiàng)數(shù)據(jù)使用2＿△△Ct法進(jìn)行分析、計(jì)算。擴(kuò)增目的基因所用引物見表1。

表1 目的基因及內(nèi)參引物

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）,兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 造模成功后，糖尿病大鼠精神萎靡，毛色暗淡，多飲、多食，體重下降。各組大鼠在飼養(yǎng)、灌胃、與水中運(yùn)動期間進(jìn)展順利。

2.2 各組大鼠心臟重塑指標(biāo)的比較 超聲檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠LVEDD 與LVESD均增高（P＜0.05），EF 降低（P＜0.05），E/A 降低（P＜0.01）；經(jīng)過8 周干預(yù)后，與模型組相比，水中運(yùn)動組、中藥內(nèi)治組和綜合康復(fù)組LVEDD、LVESD 均降低，EF 升高（P＜0.05），E/A 升高（P＜0.01）；在各治療組中，綜合康復(fù)組各項(xiàng)指標(biāo)值改善最為明顯，與水中運(yùn)動組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠心臟重塑指標(biāo)與心功能指標(biāo)的比較（）

表2 各組大鼠心臟重塑指標(biāo)與心功能指標(biāo)的比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與空白組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與模型組比較，&P＜0.01；與水中運(yùn)動組比較，○P＜0.05

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡CAI 的比較 光鏡下TUNEL 法檢測結(jié)果顯示正常狀態(tài)下心肌細(xì)胞核為藍(lán)色，陽性凋亡心肌細(xì)胞核為棕黃色，細(xì)胞核發(fā)生皺縮，體積小于正常細(xì)胞核大??；與空白組比較，模型組、水中運(yùn)動組、中藥內(nèi)治組、綜合康復(fù)組心肌細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.01）；與模型組比較，水中運(yùn)動組、中藥內(nèi)治組、綜合康復(fù)組心肌細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05）；與水中運(yùn)動組比較，綜合康復(fù)組心肌細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見表3、見圖1。

表3 各組大鼠CAI 的比較（，%）

表3 各組大鼠CAI 的比較（，%）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與水中運(yùn)動組比較，△P＜0.05

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（TUNEL，×200）

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞GRP78、Caspase-12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較 與空白組比較，模型組、水中運(yùn)動組、中藥內(nèi)治組、綜合康復(fù)組大鼠Caspase-12、GRP78 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均升高（P＜0.01）；經(jīng)過8周治療后，與模型組比較，水中運(yùn)動組、中藥內(nèi)治組、綜合康復(fù)組Caspase-12、GRP78 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均降低（P＜0.05），與水中運(yùn)動組比較，綜合康復(fù)組Caspase-12、GRP78 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組心肌細(xì)胞GRP78、Caspase-12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較（）

表4 各組心肌細(xì)胞GRP78、Caspase-12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與水中運(yùn)動組比較，△P＜0.05

3 討論

糖尿病對心臟危害極大，是心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。心肌細(xì)胞體外研究顯示高血糖合并高血脂狀態(tài)可顯著改變心肌細(xì)胞形態(tài)與空間排列并誘發(fā)心肌細(xì)胞大量凋亡[9]，表明糖尿病可對心臟造成廣泛且嚴(yán)重的損害。ERS 則被證明在糖尿病與心肌細(xì)胞凋亡間發(fā)揮著中介作用，借助調(diào)控ERS 對抗心肌凋亡有望成為防治糖尿病下心力衰竭的重要途徑[10]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中處于動態(tài)平衡的囊體細(xì)胞器，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、類固醇的生物合成以及鈣離子的平衡調(diào)控。生理或病理性應(yīng)激原均可改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，造成未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)積累，導(dǎo)致ERS 的發(fā)生[11]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為維持自身穩(wěn)態(tài)將啟動減少蛋白質(zhì)合成，增加折疊能力以及促進(jìn)異常蛋白清除等途徑，被稱之為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）[12]。糖尿病狀態(tài)下的高血糖、高血脂、氧化應(yīng)激狀態(tài)、炎癥反應(yīng)等病理因素易誘發(fā)心肌細(xì)胞持久的ERS，使蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）及肌醇需求酶1（Inositol-requiring enzyme1，IRE-1）與GRP78分離，轉(zhuǎn)而與未折疊蛋白結(jié)合，激活UPR 以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，但過度的ERS 將超過心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的能力，PERK、ATF6、IRE-1 三者將進(jìn)而激活下游的凋亡信號分子CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/Enhance-Binding protein Homologous protein，CHOP）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，c-JNK）、Caspase-12，激活相應(yīng)CHOP/GADD153 途徑、c-JNK 途徑、Caspases12 三條ERS凋亡路徑，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[13，14]。

本實(shí)驗(yàn)借助建立2型糖尿病大鼠模型探究了水中運(yùn)動、中藥內(nèi)治和水中運(yùn)動聯(lián)合中藥內(nèi)治對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心功能的干預(yù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白組比較，模型組大鼠心臟重塑指標(biāo)LVEDD、LVESD 增高，心功能指標(biāo)EF、E/A 下降，表明實(shí)驗(yàn)中糖尿病大鼠心臟結(jié)構(gòu)肥大，存在典型的糖尿病心臟病變，并出現(xiàn)心功能下降。三個治療組經(jīng)8周相應(yīng)干預(yù)后，糖尿病大鼠心臟重塑和心功能均得到明顯改善，且綜合康復(fù)組心臟重塑和心功能改善優(yōu)于單獨(dú)水中運(yùn)動組。有糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)表明[15]，運(yùn)動訓(xùn)練可通過調(diào)控NADPH 氧化酶活性減輕大鼠心臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而抑制糖尿病大鼠心臟重塑，保護(hù)心功能。楊海玉等[16]發(fā)現(xiàn)丹參中活性成分丹參酮可通過抑制糖尿病大鼠心肌中NF-κB 通路，減輕炎癥反應(yīng)，對糖尿病大鼠心肌提供保護(hù)。上官若男等[17]的研究表明，游泳運(yùn)動干預(yù)后糖尿病大鼠心室肥厚和心肌纖維化病變得到明顯改善。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示水中運(yùn)動和中藥內(nèi)治均具有縮小心臟肥大性改變、增強(qiáng)心肌收縮力、提升心臟射血功能的作用，與任磊等[18]的研究結(jié)果相似。研究表明[19]，糖尿病患者和糖尿病動物模型心臟中均可發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡增加。本實(shí)驗(yàn)中心肌組織TUNEL 染色結(jié)果同樣顯示，糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平顯著升高，由于心肌細(xì)胞無增殖能力，凋亡后將直接影響心臟收縮與舒張，符合本實(shí)驗(yàn)中觀察到的糖尿病大鼠心功能下降現(xiàn)象。符顯昭等[20]應(yīng)用人參、麥冬、丹參、五味子、黃芪等配伍成中藥復(fù)方，可有效降低糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平。鄧爽等[21]研究發(fā)現(xiàn)，4 周游泳運(yùn)動預(yù)適應(yīng)可減少促凋亡因子表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌重構(gòu)模型小鼠心功能，延緩心力衰竭進(jìn)展。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水中運(yùn)動與中藥內(nèi)治均可減少糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合下的綜合康復(fù)組心肌凋亡和心功能改善最佳。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，通過對各組實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織ERS 標(biāo)志分子GRP78、Caspase-12 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平比較分析發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平顯著升高，而三種康復(fù)治療方法均能明顯降低心肌細(xì)胞GRP78、Caspase-12 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，提示各治療組心肌細(xì)胞凋亡水平的下降與抑制過度ERS所激活的Caspase-12 凋亡通路有關(guān)，這與金娟等[22]和常盼等[23]所報(bào)道的抑制ERS 凋亡通路，可降低心肌細(xì)胞凋亡水平的發(fā)現(xiàn)相符。另外，據(jù)相關(guān)臨床線性回歸分析報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78 可協(xié)助診斷心力衰竭，評估心衰患者病情預(yù)后[24]。本實(shí)驗(yàn)中水中運(yùn)動組、中藥內(nèi)治組和綜合康復(fù)組的糖尿病大鼠經(jīng)8 周相應(yīng)治療后心肌細(xì)胞GRP78 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平相對模型組大鼠明顯降低，提示上述三種康復(fù)治療方法具有改善心力衰竭預(yù)后的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，細(xì)胞凋亡是糖尿病下心肌細(xì)胞發(fā)生過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的主要結(jié)局之一，心臟重塑則是大量心肌細(xì)胞因凋亡而丟失后的必然結(jié)果，減少心肌細(xì)胞凋亡可保護(hù)糖尿病患者心功能，降低其心力衰竭發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)水中運(yùn)動聯(lián)合中藥內(nèi)治下的綜合康復(fù)治療可有效抑制糖尿病下心臟重塑，提升心功能，其機(jī)制與減輕心肌細(xì)胞過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制Caspase-12 凋亡通路有關(guān)。