余悅?cè)A，梁桓熙，辛雨濛，孫震曉

(北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 102488)

胃癌是消化道常見惡性腫瘤，在我國癌癥發(fā)病率中高居第2 位，死亡率排第3 位，嚴重危害人類健康[1]。目前治療措施主要有手術(shù)治療、放化療和靶向治療等，但對于晚期胃癌患者治療措施有限，且往往不良反應(yīng)嚴重[2-3]。

甘草干姜湯(licorice and dried ginger decoction，LDGD)源自張仲景的《傷寒雜病論》，由甘草和干姜以2∶1的比例混合煎煮而成，是《傷寒論》中精簡小方的典型代表[4]。在臨床上，有學者應(yīng)用甘草干姜湯治療寒性胃脘痛28 例[5]。甘草對乳腺癌細胞、艾氏腹水腫瘤、尤利希腫瘤、子宮內(nèi)膜癌和其他惡性腫瘤的生長和增殖具有顯著影響[6]。張明發(fā)等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在使用干姜治療晚期癌癥患者的癌性疼痛時，干姜可以起到提高癌癥患者生活質(zhì)量的作用。

中藥含藥血清是指根據(jù)實驗設(shè)計的需要用中藥(單味或復方)按照一定的劑量、規(guī)定的劑型(大多用中藥煎湯)和預(yù)定的給藥次數(shù)、給藥時間等對特定的動物如大鼠、小鼠、豚鼠和兔等進行灌胃后，選擇適宜的采血法在擬定的時間內(nèi)采集動物的血液并對其進行分離，最后得到的含有藥物本身、藥物代謝產(chǎn)物、活性成分、雜質(zhì)成分和一定酸堿度變化等的血清復合 物[8]。與中藥提取物相比，含藥血清一定程度上代表了中藥體內(nèi)代謝后藥物的作用，本實驗選取人胃腺癌細胞AGS 和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC，體外考察甘草、干姜和甘草干姜湯含藥血清對兩個細胞系的作用，初步考察其對腫瘤細胞和正常內(nèi)皮細胞的區(qū)別。

針對中藥多成分、多靶點、多途徑的特點，網(wǎng)絡(luò)藥理學可以將中藥有效成分作用于人體的靶向過程及有關(guān)蛋白質(zhì)借助網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)通過量與質(zhì)的有效積累進行模擬和研究[9]，為進一步實驗研究提供思路。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學探討LDGD 抗胃癌的作用靶點和通路，并通過分子對接技術(shù)考察文獻報道的LDGD中8種藥效成分(甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚)[10]與甘草干姜湯抗胃癌關(guān)鍵靶點的結(jié)合情況，系統(tǒng)分析“疾病-基因-靶點-藥物”關(guān)系，為后續(xù)實驗研究和應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞株人胃腺癌細胞AGS、人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC 購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞庫，由北京中醫(yī)藥大學生命科學學院生物制藥系凍存。

1.1.2 動物20 只SD 雄性大鼠購于北京斯貝福公司，合格證號SCXK(京)2019-0010。

1.1.3 藥物甘草、干姜飲片購自安國市昌達中藥材飲片有限公司(甘草批號1801001，干姜批號1806001)。

1.1.4 主要實驗試劑RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。DMSO購自Sigma公司；青霉素、鏈霉素溶液、四甲基噻唑藍(MTT)均購自Amresco公司；胰蛋白酶購自北京拜爾迪生物科技有限公司。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)購自Ameresco 公司，氯化鈉(NaCl)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氫氧化鈉(NaOH)均購自北京化學試劑公司。

1.2 方 法

1.2.1 甘草、干姜及甘草干姜湯提取物的制備將中藥藥材與10倍于藥材質(zhì)量的純水使用加熱回流的方式進行提取，從微沸時開始計時，2 h 后轉(zhuǎn)移藥液，再加入8 倍于質(zhì)量的純水進行提取，再次微沸時開始計時，1.5 h后與之前藥液合并，離心除渣后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，將濃縮后的藥液置于-80 ℃預(yù)凍，過夜后使用凍干機進行凍干，凍干48 h，得到中藥凍干粉。根據(jù)最后所得凍干粉的質(zhì)量和生藥量來計算凍干粉得率。

1.2.2 LDGD 含藥血清的制備取健康SD(體質(zhì)量180~190 g)大鼠20只，按體質(zhì)量隨機分為給藥組和空白對照組，給藥組分為甘草組、干姜組、甘草：干姜不同配比(分別為2∶1、1∶1、1∶2)的甘草干姜湯組，按照每次4.5 g/kg(相當于人臨床劑量的30倍)進行給藥，每只大鼠每次灌胃2 mL，每天早晚各兩次，空白對照組灌胃等量的蒸餾水。連續(xù)灌胃3 d，第3天給藥后禁食。第4 天末次給藥1 h 后，使用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，將血液靜置40 min 后3 000 r/min 離心15 min。將每組血清混勻，在56 ℃水浴鍋中溫育30 min進行滅活，用0.22 μm過濾除菌后分裝保存于-20 ℃。用時將含藥血清加入到無血清培養(yǎng)基中稀釋至所需濃度進行實驗，同時設(shè)相同稀釋倍數(shù)對照組大鼠血清為含藥血清實驗溶劑對照組。

1.2.3 LDGD含藥血清的抗腫瘤作用實驗取對數(shù)生長期的細胞，以每孔1 000 個接種于96 孔板，每孔100 μL，CO2體積分數(shù)5%、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。待細胞貼壁生長良好，加入含有含藥血清的RPMI-1640培養(yǎng)基150 μL，甘草、干姜、甘草干姜湯提取物均設(shè)10%、20%、30%等3個濃度，空白對照組為含10%、20%、30%空白大鼠血清的1640 培養(yǎng)基，CO2體積分數(shù)5%、37 ℃條件下培養(yǎng)24、48 h。去除培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mg/mL 的MTT 100 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL充分溶解深藍色甲瓚結(jié)晶，酶標儀570 nm測吸光度D(570)。

1.2.4 甘草干姜湯化學成分收集及藥物靶點預(yù)測利用中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)庫TCMSP[11](http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，通過設(shè)置篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)30%、類藥性指數(shù)(drug-like properties，DL)≥0.18[12]，篩選甘草、干姜的有效化學成分并獲取其相關(guān)靶點；另外通過文獻調(diào)研，將不符合類藥篩選但在甘草、干姜中含量高或具有良好抗腫瘤活性的成分納入成分集。

利用數(shù)據(jù)庫Genecards[13](https://www.genecards.org/)，以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞篩選，獲取人胃癌相關(guān)的靶點，選擇Relevance score＞30 的人胃癌相關(guān)靶點。

應(yīng)用R 語言中的在線程序Draw Venn Diagrams 對獲取到的甘草干姜湯藥物靶點與胃癌靶點取交集靶點，作為甘草干姜湯抗胃癌的潛在作用靶點。

1.2.5 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將甘草干姜湯抗胃癌的潛在作用靶點導入到Cytoscape 3.8.0 中，構(gòu)建成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)并進行分析，以Degree 作為評價節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性的標準。

1.2.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及LDGD 抗胃癌關(guān)鍵靶點的篩選將交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建PPI 功能蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.8.0中的CytoNCA插件進行網(wǎng)絡(luò)分析。

1.2.7 GO 功能和KEGG 信號通路富集分析利用R語言中的軟件包Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)對交集靶點的細胞成分、分子功能、生物學過程以及信號通路進行富集分析。首先將基因Symbol轉(zhuǎn)化為基因ID，選擇物種為人(Homo spanies)，設(shè)定閾值為P＜0.05，輸出富集結(jié)果并繪制條形圖與氣泡圖。

1.2.8 分子對接利用Discovery Studio 2.5 中的LibDock 將PPI 結(jié)果中排名靠前的抗胃癌關(guān)鍵靶點與LDGD 中的8 種藥效活性成分(甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚)進行分子對接，來探究LDGD中的藥效成分是否能與關(guān)鍵靶點結(jié)合從而發(fā)揮抗胃癌作用。

為驗證初步定義的活性位點參數(shù)的正確性及可重復性，取出原配體，再利用分子對接程序重新將原配體對接進入初步定義的活性位點，采用計算均方根偏差(root-mean-square deviation，RMSD)作為評價活性位點準確性的參數(shù)，以原配體打分值的80%設(shè)為閾值，將打分值高于閾值且相互作用模式與原配體相似的篩選化合物定義為潛在的活性化合物[14-15]。其中，VEGFA沒有含抑制劑原配體的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，故選取VEGFA 抑制劑哌加他尼(Pegaptanib)[16]與VEGFA 對接，將8 種藥效成分的對接結(jié)果與抑制劑哌加他尼的對接結(jié)果進行比較。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24 和Graphpad prism7 軟件進行統(tǒng)計學分析，用xˉ±s表示，使用單因素方差分析對多樣本均數(shù)進行比較，使用t檢驗對兩樣本均數(shù)進行比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清藥理學實驗結(jié)果

實驗結(jié)果見圖1、2，LDGD 含藥血清對人胃腺癌細胞AGS有顯著的抑制作用；而含藥血清對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC 無明顯抑制作用；并且單味藥給藥的抑制效果遠小于復方給藥效果。

圖1 甘草、干姜及甘草干姜湯大鼠含藥血清對人胃腺癌細胞AGS活力的影響

2.2 甘草干姜湯的化學成分及靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共收集甘草干姜湯中101個化學成分，將化合物的靶點進行合并去重處理后，共得到LDGD 成分對應(yīng)的靶點220 個，通過對數(shù)據(jù)庫檢索獲得胃癌相關(guān)靶點549 個，兩者的交集靶點作為LDGD的潛在抗胃癌靶點共94個，結(jié)果如圖3所示。

圖3 LDGD化學成分相關(guān)靶點和胃癌相關(guān)靶點的Veen圖

2.3 構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

運用Cytoscape 3.8.0中的Import Network插件構(gòu)建甘草干姜湯化學成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)，如圖4所示?；虬袠藶榉叫危换瘜W成分為圓形，其中甘草成分為綠色，干姜成分為紅色。

圖4 LDGD化學成分及其相關(guān)靶點的作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 甘草、干姜及甘草干姜湯大鼠含藥血清對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC活力的影響

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及LDGD抗胃癌關(guān)鍵靶點的篩選

LDGD 的潛在抗胃癌靶點構(gòu)建的PPI 如圖5 所示，進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點。LDGD抗胃癌核心靶點篩選規(guī)則：介度中心性(betweenness centrality)，緊密中心性(closeness centrality)，節(jié)度中心 性(degree centrality)， 特 征 向 量(eigenvector centrality)，局部連通性(local average connectivitybased method lac)，各組數(shù)值中大于本組中位值的基因予以保留，按照Degree數(shù)值進行排序，篩選出的20個LDGD 抗胃癌核心靶點結(jié)果如表1 所示。按上述規(guī)則重復篩選3 次，得到LDGD 抗胃癌的關(guān)鍵靶點為VEGFA、TNF-α、CASP3、MYC，如圖6所示。

圖6 LDGD抗胃癌關(guān)鍵靶點的篩選

表1 LDGD抗胃癌核心靶點拓撲分析結(jié)果

圖5 LDGD抗胃癌潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

對LDGD 潛在抗胃癌靶點進行GO 功能富集分析，如圖7所示，細胞成分44個，主要有細胞周期蛋白依賴性激酶、膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等。生物學過程2 227 個，主要有對氧化應(yīng)激、凋亡信號通路、活性氧、金屬離子、脂多糖的調(diào)節(jié)等。分子功能135 個，主要有泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、四吡咯結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合等。

圖7 LDGD潛在抗胃癌靶點的GO功能富集分析

對LDGD 潛在抗胃癌靶點進行KEGG 通路富集分析，結(jié)果如圖8 所示，橫坐標表示富集到基因的數(shù)量，左邊表示通路名稱，顏色表示P值，P值越小顏色越偏向紅色，P值越大則越偏向藍色。LDGD 抗胃癌機制主要涉及TNF 信號通路、p53 信號通路、細胞凋亡等。

圖8 LDGD潛在抗胃癌靶點的KEGG通路富集圖

2.6 分子對接結(jié)果

LDGD 的8 種藥效成分(甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚)與抗胃癌的關(guān)鍵靶點(VEGFA、TNF-α)的對接結(jié)果如表2所示，結(jié)合方式如圖9、10所示。

圖9 LDGD 8種藥效成分和VEGFA的對接結(jié)果

表2 對接結(jié)果

所有分子均能與VEGFA 對接成功，其中8-姜酚、甘草酸、甘草苷對接分數(shù)均高于閾值(哌加他尼對接分數(shù)的80%)。其中6種小分子與TNF-α的對接分數(shù)均高于閾值(原配體對接分數(shù)的80%)。甘草酸、甘草苷、6-姜酚與兩個關(guān)鍵靶點的對接分數(shù)較高、親和力較強，且甘草酸、甘草苷、6-姜酚在甘草干姜湯中的含量較高，推測其可能是甘草干姜湯中抗胃癌的關(guān)鍵藥效成分。

圖10 LDGD 6種小分子藥效成分和TNF-α的對接結(jié)果

3 討 論

本研究通過血清藥理學初步探究了甘草干姜湯的體外抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其對人胃腺癌細胞AGS有顯著的抑制作用，而對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC 無明顯抑制作用，對兩者作用有區(qū)別。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測了甘草干姜湯抗胃癌的關(guān)鍵靶點為VEGFA、CASP3、MYC、TNF-α，可能通過對凋亡信號、氧化應(yīng)激、活性氧的調(diào)節(jié)等途徑發(fā)揮抗胃癌作用，通過激活TNF、p53 等信號通路來抑制胃癌細胞增殖；文獻報道的LDGD 中8 種主要成分與抗胃癌關(guān)鍵靶點VEGFA、TNF-α的分子對接結(jié)果提示甘草酸、甘草苷、6-姜酚可能為LDGD抗胃癌的關(guān)鍵藥效成分。

腫瘤的發(fā)生通常伴隨著炎癥反應(yīng)，適當針對TNF-α開發(fā)抑制劑可能是一種新的治療腫瘤的方式，但仍需要進一步的探索[17]。TNF-α高表達與胃癌的分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可參與胃癌病癥的發(fā)生、進展[18]。VEGFA由內(nèi)皮細胞以及腫瘤等多種細胞分泌，其最初被證明是一種內(nèi)皮生長因子以及血管通透性的調(diào)節(jié)因子[19-20]。VEGFA 是實體瘤生長過程中血管生成的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)VEGFA/VEGFR2 信號通路的激活會促進胰腺導管腺癌的侵襲、遷移和血管生成[21]。靶向VEGFA的治療方案成為了腫瘤學的創(chuàng)新性治療方法。而分子對接結(jié)果表明LDGD 中可能含有抑制VEGFA、TNF-α的藥效成分，提示LDGD 可能通過抑制VEGFA、TNF-α來發(fā)揮抗胃癌作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)甘草干姜湯具有一定的抗胃癌作用，并初步探討甘草干姜湯潛在的抗胃癌作用機制，為甘草干姜湯的抗胃癌研究提供了一定參考。受網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接自身性質(zhì)的限制，及甘草干姜湯藥效成分研究的不足，關(guān)于其抗胃癌的機制需要更進一步研究。