劉曉寧，耿 薔，徐江垚，林桂淼，王曉梅，郭遂群

(1．南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州 510600；2．深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518100；3．深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部國(guó)際腫瘤中心，廣東 深圳 518055)

量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)亦稱作半導(dǎo)體納米晶體，是一種三維尺度均在2~10 nm的半導(dǎo)體納米熒光顆粒，不僅具有光穩(wěn)定性好、抗光漂白，具有寬吸收窄發(fā)射及高生物相容性[1]等優(yōu)良特性，而且熒光強(qiáng)度高、特異性強(qiáng)，可用于生物分子的多色標(biāo)記，亦可實(shí)現(xiàn)單分子示蹤，其表面還能作相應(yīng)修飾以獲得良好的生物相容性，故在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[2-3]，尤其在單分子標(biāo)記、靶蛋白示蹤等活體成像中更具有應(yīng)用前景，但其生物安全性尚不清楚，尤其是對(duì)人體卵母細(xì)胞的影響尚缺少報(bào)道，本課題組前期觀察量子點(diǎn)對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其主要進(jìn)入顆粒細(xì)胞發(fā)揮作用[4-5]。因人卵母細(xì)胞的特殊稀缺性與倫理限制而很難直接觀察其毒性，顆粒細(xì)胞通過細(xì)胞質(zhì)穿過透明帶與卵母細(xì)胞膜形成縫隙連接，為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的雙向信息交流及新陳代謝物質(zhì)傳遞主要通過縫隙連接蛋白43和連接蛋白45 進(jìn)行[6]?？p隙連接的變化可改變卵母細(xì)胞成熟狀態(tài)[7]。本研究采用人超排卵母細(xì)胞周圍的卵顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，檢測(cè)聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾的CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)(非鎘量子點(diǎn))對(duì)顆粒細(xì)胞的毒性效應(yīng)，間接反映納米材料對(duì)人卵母細(xì)胞的毒性效應(yīng)，為CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)在臨床應(yīng)用中的生物安全性評(píng)估提供信息。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CuInS2/ZnS量子點(diǎn)(Najing Tech公司)；透明質(zhì)酸酶(Sigma 公 司)； TUNEL Assay 試 劑 盒-FITC 熒 光(Colorimetric，Abcam)；Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒(DOJINDO公司)；CCK-8試劑盒及人卵顆粒細(xì)胞內(nèi)的丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione， GSH) 與谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)均為國(guó)產(chǎn)檢測(cè)試劑盒；總RNA 提取試劑盒(成都福際生物公司)；Taq Master Mix(Gene Solution 公 司)；SYBR?Green PCR Master Mix(TaKaRa Bio 公司)；GoScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)； 雌 二 醇(E2)/孕 酮(P4) 試 劑 盒(Roche Diagnostics公司)。

主要儀器包括：三氣培養(yǎng)箱(ASTECAPM50D 公司)；超凈工作臺(tái)(江蘇安泰)；單人IVF 工作站(STERILE181ICSIHIMAC 公 司)；離 心 機(jī)(Eppendorf 公司)；體視顯微鏡(日本，SZX10 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems 公 司)；流 式 細(xì) 胞 儀(BD 公司)；酶標(biāo)儀(MD公司)。

1.2 體外獲取人卵巢顆粒細(xì)胞及原代培養(yǎng)

收集2020 年6 月—2020 年8 月在深圳恒生醫(yī)院生殖中心行體外受精/卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射(IVF/ICSI)的不孕癥患者13例超排卵，迅速將吸出的卵泡液及沖洗液倒入培養(yǎng)皿中，用吸管吸出可見的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(oocyte-corona-cumulus complex，OCCs)放入培養(yǎng)液中，示意圖見圖1A。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~4 h后用透明質(zhì)酸酶消化OCCs，收集顆粒細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。所有研究對(duì)象均自愿參加，本研究獲深圳恒生醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)編號(hào)HSYY-SZ-2019-001)及生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(生殖倫理批準(zhǔn)編號(hào)HSYY-SZ-2019-002)通過后采集人體樣本，所有患者均已簽署知情同意書。

將上述人卵顆粒細(xì)胞收集至離心管，加入M199培養(yǎng)基4 mL，并以1 500 r/min離心5 min。用培養(yǎng)基洗滌兩次，棄去上清液，添加含20% FBS 的M199 培養(yǎng)基重懸，將其接種在培養(yǎng)皿中，然后置于37 °C、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)與量子點(diǎn)表征

將顆粒細(xì)胞分離并置于單獨(dú)培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后分組培養(yǎng)：設(shè)立PBS 對(duì)照組，CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)低(1 μg/mL)、中(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)3 個(gè)劑量組，培養(yǎng)示意圖見圖1B。使用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)量CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)的流體動(dòng)力學(xué)直徑和Zeta 電位。圖1C顯示CuInS2/ZnS量子點(diǎn)的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑約為14~17 nm。圖1D 顯示CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)的代表性透射電子顯微鏡圖像，CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)的Zeta 電位約為-13.52 mV。圖1E 顯示CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)的消光和光致發(fā)光光譜，量子點(diǎn)的發(fā)射峰約為610 nm。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖與量子點(diǎn)表征

1.4 CCK-8法檢測(cè)顆粒細(xì)胞活力

采用陽性對(duì)照藥物5-Fu驗(yàn)證顆粒細(xì)胞對(duì)毒性檢測(cè)的靈敏性。用透明質(zhì)酸酶消化志愿者卵母細(xì)胞上的顆粒細(xì)胞后，將顆粒細(xì)胞分離并轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞貼壁后，分別將不同濃度的5-Fu添加到培養(yǎng)基中。在顆粒細(xì)胞貼壁后，將5-Fu 設(shè)置7 個(gè)濃度(0.031 6、0.1、0.316、1、3.16、10 和31.6 μmol/L)梯度加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，24 h后檢查細(xì)胞活力計(jì)算半數(shù)活性抑制濃度(IC50)。隨后顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)1~6 d，使用CCK-8法動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞存活變化，確定原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞狀態(tài)，為后續(xù)毒性檢測(cè)確定最佳時(shí)間。并檢測(cè)CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理48 h 后人卵顆粒細(xì)胞的IC50。細(xì)胞活力檢測(cè)按CCK-8 試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過酶標(biāo)儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組在450 nm 處的吸光度值計(jì)算細(xì)胞活力，每組設(shè)3 個(gè)平行樣，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 TUNEL 法和Annexin V/PI 雙染色法分別檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡

細(xì)胞分組培養(yǎng)后，CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理48 h 檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。TUNEL 法檢測(cè)中，按照TUNEL Assay-FITC 熒光試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞DNA片段化情況。

Annexin V/PI 雙染色法檢測(cè)：調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，取100 μL 放入檢測(cè)管中，加入5 mL PBS 洗滌，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清，用孵育緩沖液洗滌1 次，1 000 r/min 離心5 min。棄去上清，向沉淀內(nèi)加入100 μL Annexin V 標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10~15 min，沉淀細(xì)胞用孵育緩沖液洗1 次，加入PI 溶液室溫孵育20 min，避光上機(jī)檢測(cè)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)顆粒細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)

細(xì)胞分組培養(yǎng)后，CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理48 h 收獲顆粒細(xì)胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA。利用GoScript 逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega，A5004)對(duì)RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)合成顆粒細(xì)胞功能相關(guān)基因引物(見表1)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)技術(shù)檢測(cè)如下基因的表達(dá)：睪酮合成調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白(steroidogenic acute regulatory，StAR)、細(xì)胞色P450 側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450 side chain cleavage enzyme，P450scc)，細(xì)胞色P450 芳香化酶(cytochrome P450 aromatase，P450arom)、雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)、雌激素受體β(estrogen receptorβ，ERβ)、 3β-羥 基 類 固 醇 脫 氫 酶(3βhydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)、17β羥化類固醇脫氫酶(17 β hydroxylated steroid dehydrogenase17β-HSD)、 黃 體 生 成 素 受 體(luteinizing hormone receptor，LHR)、卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)。在ABI 7500 DNA 實(shí) 時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)：95 ℃變性5 min 后30 個(gè)PCR 循環(huán)：95 ℃、1 min，58 ℃、1 min，72 ℃、1 min。隨后在SYBR Green PCR Mix 中進(jìn)行定量，按2-ΔΔCT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 顆粒細(xì)胞功能相關(guān)基因引物序列信息

1.7 顆粒細(xì)胞分泌雌二醇與孕酮的檢測(cè)

各組細(xì)胞在量子點(diǎn)處理48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，所有標(biāo)本收集后于-80 ℃分裝凍存。送醫(yī)院檢驗(yàn)科采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)法檢測(cè)細(xì)胞上清液中雌二醇(E2)以及孕酮(P)含量。

1.8 顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)檢測(cè)

分組培養(yǎng)顆粒細(xì)胞并接種于6 孔板內(nèi)，24 h 后更換含有終濃度分別為1、10、100 μg/mL CuInS2/ZnS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，顆粒細(xì)胞用PBS 洗滌3次，用預(yù)冷的裂解液裂解后，于4 ℃下1 000 r/min離心15 min，保留上清液用于測(cè)定MDA、T-AOC、TSOD、GSH 與GSH-PX 的活性。分別按照試劑盒操作步驟測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果依照說明書進(jìn)行計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均用xˉ±s表示，兩組之間的差異通過兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5-Fu驗(yàn)證體外原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的毒性敏感性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與PBS對(duì)照組相比，5-Fu可明顯抑制顆粒細(xì)胞活性(P＜0.01)。1 μmol/L 時(shí)5-Fu 對(duì)細(xì)胞活性的抑制率為(40.35±3.89)%，10 μmol/L 時(shí)活性抑制率為(85.30±4.32)%，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.958，P＜0.05)。5-Fu 抑 制顆 粒細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 的IC50值 為1.227 μmol/L(圖2A)。同時(shí)我們對(duì)0.5、1、2 μmol/L 5-Fu處理的顆粒細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，5-Fu處理后的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)明顯早期凋亡特征(圖2B 和C)。5-Fu 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率在10 μmol/L時(shí)是1 μmol/L 的2.37±1.84 倍，顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖2 5-Fu驗(yàn)證體外原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的毒性效應(yīng)

2.2 CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)對(duì)顆粒細(xì)胞活力和凋亡率的影響

在顆粒細(xì)胞貼壁后，分別將1、10、100 μg/mL CuInS2/ZnS量子點(diǎn)添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。從第1天到第6 天，每天動(dòng)態(tài)檢查細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，顆粒細(xì)胞在第3 天開始出現(xiàn)自發(fā)凋亡(顆粒細(xì)胞出現(xiàn)黃素化，圖3A)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在體外培養(yǎng)48 h 顆粒細(xì)胞功能良好狀態(tài)下進(jìn)行毒性檢測(cè)。不同劑量CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)作用48 h觀后顆粒細(xì)胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴性下降(r=0.9631，P＜0.05)，CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)對(duì)顆粒細(xì)胞的IC50值為66.72 μg/mL(圖3B)。對(duì)CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理的顆粒細(xì)胞采用TUNEL和Annexin V/PI雙染色法流式細(xì)胞儀分別進(jìn)行凋亡檢測(cè)：TUNEL凋亡測(cè)試的結(jié)果表明，CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后，顆粒細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的DNA 片段化，并隨著劑量增加呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(圖3C和D)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果亦表明，CuInS2/ZnS量子點(diǎn)處理后的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)顯著細(xì)胞早期凋亡特征(圖3E和F)。

圖3 CuInS2/ZnS量子點(diǎn)對(duì)顆粒細(xì)胞活力和凋亡的影響

2.3 CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞雌激素與孕激素釋放

排卵后顆粒細(xì)胞生物功能為分泌孕酮(P)和雌二醇(E2)，它們?cè)谏诚到y(tǒng)中起著非常重要的作用。CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后，在顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測(cè)到E2和P，表明其生理功能正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后顆粒細(xì)胞大量釋放內(nèi)源性E2和P 與PBS 對(duì)照組比較，E2 和P 顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖4A 和B)，且明顯上調(diào)FSH 受體、17β羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)、3β羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)、細(xì)胞色素P450 芳香化酶(P450arom)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(圖4C)。

圖4 CuInS2/ZnS量子點(diǎn)引發(fā)顆粒細(xì)胞孕雌激素釋放并上調(diào)相關(guān)基因表達(dá)

2.4 CuInS2/ZnS量子點(diǎn)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 和100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)顯著增加顆粒細(xì)胞中的ROS 含量(P＜0.05 或P＜0.01，圖5A和B)。與PBS對(duì)照組相比，1 μg/mL 量子點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的顆粒細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的活性未發(fā)生顯著變化，而10 和100 μg/mL 量子點(diǎn)處理后顆粒細(xì)胞中的MDA、T-AOC 及T-SOD 活性均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，100 μg/mL 量子點(diǎn)的GSH 活性顯著高于PBS 對(duì)照組(P＜0.01)，GSH-PX明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。

圖5 CuInS2/ZnS量子點(diǎn)處理后細(xì)胞中氧化損傷情況

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行了人類卵顆粒細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)，原代培養(yǎng)的細(xì)胞可以保留其分泌雌、孕激素的功能特性，相關(guān)研究亦證實(shí)其體外培養(yǎng)的可行性[8-10]，并且對(duì)不同濃度的5-Fu 具有敏感的毒性檢測(cè)反應(yīng)性，呈現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，結(jié)果表明原代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞可以檢測(cè)理化因子的毒性效應(yīng)，與國(guó)外相關(guān)報(bào)道一致[11-13]。但持續(xù)6 d 體外原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞在第3 天出現(xiàn)自發(fā)凋亡現(xiàn)象，提示細(xì)胞開始黃素化，因此，毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)我們控制在體外培養(yǎng)72 h以內(nèi)開展各項(xiàng)檢測(cè)。利用此細(xì)胞體系，我們觀察不同濃度CuInS2/ZnS量子點(diǎn)作用48 h對(duì)人卵顆粒細(xì)胞的毒性效應(yīng)并探索其損傷機(jī)制。

中、高劑量CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后，顆粒細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的DNA片段化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并呈現(xiàn)劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果亦表明，CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡發(fā)生。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)非鎘量子點(diǎn)對(duì)多種細(xì)胞具有毒性作用：Chen 等[14]報(bào)道InP/ZnS量子點(diǎn)對(duì)鯽魚卵母細(xì)胞具有明顯毒性，本研究團(tuán)隊(duì)課題組報(bào)道InP/ZnS 量子點(diǎn)表面不同亞基修飾后對(duì)肺癌細(xì)胞HCC-15和正常肺泡上皮細(xì)胞RLE-6TN均引發(fā)明顯凋亡，濃度在20~80 μg/mL 范圍內(nèi)的量子點(diǎn)可以引起細(xì)胞損傷，增加壞死細(xì)胞的數(shù)量，顯著降低細(xì)胞活力，并表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞IC50為66.72 μg/mL，結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)果基本一致。

顆粒細(xì)胞受損后可以釋放內(nèi)源性激素，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量組量子點(diǎn)明顯促進(jìn)顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮的釋放，與量子點(diǎn)損傷激活并上調(diào)FSH 受體、17β羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)、3β羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)、細(xì)胞色素P450 芳香化酶(P450arom)的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平密切相關(guān)，Du等[12]發(fā)現(xiàn)甲基醚通過抑制細(xì)胞色素P450芳香化酶功能可以抑制人卵顆粒細(xì)胞雌激素生物合成，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)可以激活細(xì)胞色素P450芳香化酶功能促進(jìn)雌激素合成與釋放，其可能的分子機(jī)制有待后續(xù)深入研究。

氧化損傷主要是由ROS產(chǎn)生增加引起的。本研究顯示CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后，具有促進(jìn)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS 的能力，亦有文獻(xiàn)報(bào)道了InP/ZnS 量子點(diǎn)明顯增加肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS 含量[13]。當(dāng)ROS 的產(chǎn)生超過人體的抗氧化能力時(shí)，將嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常功能，并可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化損傷、酶失活、脂質(zhì)過氧化和DNA鏈斷裂。為了抵消ROS的毒性作用，細(xì)胞啟動(dòng)由酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)組成的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行防御。還原型谷胱甘肽(GSH)是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，其過度氧化和細(xì)胞中總谷胱甘肽濃度的降低可能是導(dǎo)致人體抗氧化能力下降的原因。GSH-PX 具有將體內(nèi)過量的過氧化物還原為無毒的羥基化合物和H2O，從而降低氧化毒性。MDA是主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的變化可用作判斷自由基對(duì)人體損害程度的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用量子點(diǎn)處理的人卵顆粒細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生量顯著增加，并表現(xiàn)出劑量依賴性，表明量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞后存在氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)暴露使MDA 含量顯著增加，并且中(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)劑量量子點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組中MDA 含量呈顯著增加趨勢(shì)，表明量子點(diǎn)對(duì)人卵顆粒細(xì)胞具有明顯的自由基損傷作用。暴露于100 μg/mL 量子點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致人卵顆粒細(xì)胞中GSH 含量顯著增加，這表明當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，人卵顆粒細(xì)胞會(huì)增加GSH 含量并促進(jìn)其與有毒物質(zhì)(量子點(diǎn))的結(jié)合以防止自由基損害。SOD、CAT 和GSH-PX 是研究最多的抗氧化酶，其中SOD 主要負(fù)責(zé)去除超氧陰離子自由基，CAT主要負(fù)責(zé)過氧化氫的分解，而GSH-PX 主要負(fù)責(zé)去除H2O2和脂質(zhì)過氧化物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量CuInS2/ZnS量子點(diǎn)顯著抑制TSOD和CAT的活性，表明量子點(diǎn)誘導(dǎo)人卵顆粒細(xì)胞活性氧自由基的增加，CAT降低將引起H2O2堆積，超過T-SOD 和SOD 的清除能力而引起氧化損傷。用100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后，人卵顆粒細(xì)胞的GSH-PX 活性明顯降低，表明GSH-PX 被抑制在一定程度上可提高過氧化水平，可見，細(xì)胞有限的修復(fù)能力不能完全解決量子點(diǎn)引起的毒性作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)成功建立了體外培養(yǎng)的人卵顆粒細(xì)胞毒性檢測(cè)體系，CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)可以通過侵入顆粒細(xì)胞導(dǎo)致氧化損傷發(fā)生細(xì)胞凋亡，其毒性的分子機(jī)制有待更深入研究。

致謝：感謝深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室所有成員收集標(biāo)本，感謝深圳大學(xué)(西麗校區(qū))儀器分析中心提供的幫助。